Одной из самых значимых проблем в гастроэнтерологии были и остаются воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), занимающие одну из ведущих позиций по тяжести течения, частоте осложнений и летальности в структуре болезней желудочно-кишечного тракта [2, 5, 6]. Актуальность проблемы ВЗК на современном этапе неоспорима, что обусловлено неизвестной этиологией, ростом заболеваемости лиц трудоспособного возраста, отсутствием специфического лечения, рецидивирующим течением, развитием угрожающих жизни осложнений, необходимостью проведения длительной, часто пожизненной, дорогостоящей терапии и неблагоприятным медико-социальным прогнозом [1].
ВЗК характеризуются неспецифическим иммунным воспалением в стенке кишки: поверхностным при ЯК и трансмуральным при БК. ЯК – хроническое заболевание, характеризующееся диффузным воспалением в пределах слизистой оболочки (СО), поражающим только толстую кишку на разном протяжении, в то время как при БК в патологический процесс вовлекаются любые органы пищеварительного тракта – от полости рта до анального канала [6, 29].
Распространенность ВЗК в разных регионах мира имеет широкую вариабельность: частота ЯК составляет от 21 до 268 случаев, а БК – от 9 до 199 случаев на 100 тыс. населения. Распространенность ВЗК в России составляет 20,4 на 100 тысяч населения для ЯК и 3,7 на 100 тысяч населения для БК [7]. Прирост заболеваемости ЯК 5-20 случаев в год, БК – 5-15 случаев в год на 100 тыс. населения. Распространенность ЯК всегда превышает распространенность БК, однако, рост заболеваемости БК в последние 20 лет более значительный, что связано с улучшением диагностики данной группы заболеваний благодаря разработке четких диагностических критериев [6]. В 30–50 % случаев ВЗК манифестируют в детском возрасте [3]. В нашей стране в структуре заболеваемости ВЗК преобладают тяжелые формы с осложнениями и высокой летальностью, что является следствием поздней диагностики: диагноз ЯК в течение первого года болезни устанавливают только в 25 % случаев, в остальных случаях диагноз подтверждается на протяжении 3–12 лет от начала клинических проявлений [6]. При установлении диагноза БК в период до трех лет осложнения развиваются в 55 %, при более поздней диагностике – в 100 % случаев. При поздней диагностике ЯК развитие тяжелых осложнений происходит в 29 % случаев [4, 6].
Отсутствие единого взгляда на проблему ВЗК среди практикующих врачей, поздняя диагностика, неадекватное лечение являются причиной тяжелого течения заболевания, инвалидизации лиц трудоспособного возраста и летальных исходов, что обусловливает не только медицинское, но и важное социальное значение БК и ЯК [2, 5, 6]. Учитывая вышесказанное, на данном этапе актуальным является разработка новых терапевтических подходов в лечении ВЗК и их доклинические испытания. Создание и исследование новых лекарственных препаратов ставит задачу экспериментального моделирования заболеваний человека.
Цель работы – провести критический анализ отечественных и зарубежных источников литературы, индексированных в базах данных РИНЦ, Pubmed, Medline, посвященных методам экспериментального моделирования ВЗК, и определить оптимальные экспериментальные модели ЯК и БК, удовлетворяющие клинической, морфологической и лабораторной картине заболеваний, характеризующиеся доступностью, быстротой методов и экономическим преимуществом.
Результаты. Анализ отечественной и зарубежной литературы позволяет сделать вывод о существовании двух базовых направлений в моделировании ВЗК: генная инженерия лабораторных животных и индукция ЯК и БК путем экзогенного введения в пищеварительный тракт химических веществ, используемых в качестве гаптенов в иммунологических реакциях.
Генная инженерия является новым, активно развивающимся направлением в медицине. В рамках экспериментального моделирования ВЗК, модификация генотипа мышей приводит к созданию «нокаутных» и «трансгенных» линий, у которых заболевание развивается спонтанно и ассоциировано с утратой иммунной толерантности каутологичной кишечной микрофлоре [4]. «Нокаутные» мыши в результате выключения у них определенного участка гена утрачивают компоненты эпителия кишечника (кератин 8-дефицитные мыши), слизь (муцин 2-дефицитные мыши), транспортный белок (мыши с дефицитом гена 1а множественной лекарственной резистентности). Выключение сигнальных молекул у таких мышей приводит к дисбалансу про- и противовоспалительных цитокинов (A20-дефицитные мыши, STAT73–/–-дефицитные мыши, ИЛ-10-дефицитные мыши) с увеличением продукции провоспалительных цитокинов (IFN-γ, ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-12), хемокинов и их рецепторов и развитием Th1-зависимого иммунного воспаления, характеризующегося инфильтрацией СО кишки иммунокомпетентными клетками (нейтрофилы, CD4+ T-клетки, B-клетки и др.) и поражением стенки кишечника, напоминающим таковое при БК. У «трансгенных» мышей следствием изменения генотипа является перестройка адаптивного иммунного ответа с активацией эффекторной функции CD4+ T-лимфоцитов (STAT4 трансгенные мыши), высокой экспрессии ИЛ-7 (ИЛ-7-трансгенные мыши) или лиганда СD40 на лимфоцитах (СD40-лигандтрансгенные мыши) с преобладанием провоспалительных медиаторов, вследствие чего после дополнительной антигенной стимуляции развиваются явления энтероколита с глубоким трансмуральным воспалением и плотным инфильтратом CD4+ T-клеток, продуцирующих ИЛ-13, IFN-γ и ФНО-α, сходные с морфологическими характеристиками ЯК у человека [11, 31].
Использование генетически модифицированных лабораторных животных в экспериментальном моделировании ВЗК позволяет получить достоверные клинико-лабораторные и морфологические изменения, характерные для ЯК или БК, однако, сопряжено со значительными финансовыми затратами и длительным временным периодом реализации экспериментальной модели. Химически индуцированные модели экспериментальных ВЗК являются приоритетными в сравнении с генноинженерными в связи с экономическим преимуществом, доступностью методов, простотой в исполнении и более быстрой реализацией модели. Различаются эти модели по: месту введения вещества (peros, perrectum), наличию/отсутствию предварительной сенсибилизации организма, веществу-индуктору (тринитробензолсульфоновая кислота (ТНБС), динитробензолсульфоновая кислота (ДНБС), декстран сульфат натрия (ДСН), уксусная кислота, оксазолон, каррагинан). Безусловно, каждая модель характеризуется рядом ограничений и недостатков наряду с достоинствами и преимуществами, исходя из чего возникает необходимость сравнения методик данных экспериментальных моделей.
По данным различных авторов, использование ТНБС достаточно распространено при экспериментальном моделировании как БК, так и ЯК у мышей, крыс и кроликов. Модель является двухэтапной: на 1 сутки эксперимента – предварительная сенсибилизация организма путем нанесения на кожу животного 150 мкл 1 % раствора ТНБС (5 % водного раствора ТНБС в растворе ацетона и оливкового масла в соотношении их 4:1), на 8 сутки эксперимента – ректальное введение 100 мкл 5 % водного раствора ТНБС и 50 % этилового спирта в соотношении 1:1 [28]. Клинические и морфологические изменения, развивающиеся в результате введения ТНБС, сходны с теми, что наблюдаются при ВЗК у человека: тяжелая диарея, потеря веса, выпадение прямой кишки, кровотечения, очаговые изъязвления, нейтрофильная инфильтрация и истончение стенки кишки, уменьшение количества крипт [23, 25]. Однако доказано, что данная кислота способствует процессу разрушения кишечной стенки с рядом существенных отличий, характерных для БК: некроз и более глубокое повреждение тканей, характерное для трансмурального воспаления при развитии БК [21]. Широко известно, что БК характеризуется иммунным ответом на основе Th-1 опосредованного механизма, а введение этанольных 45–50 % растворов ТНБС обеспечивает лучшую деструкцию СО, чему предшествует активация иммунных клеток слизистой благодаря воздействию тринитрофенилэпитопа (ТНФэ), который является антигенным стимулом для развития иммунного ответа. Данный ТНФэ инициирует иммунный ответ и стимулирует выработку IL-12, IL-23 макрофагами и дендритными клетками в эпителиальном слое СО кишечника. Учитывая этот факт, можно сделать вывод об преимущественном применения ТНБС для моделирования БК, а не ЯК [21].
Для экспериментального моделирования ЯК и БК применяется также ДНБС, растворенная в 50 % этиловом спирте, введенная perrectum на глубину 8 см с помощью катетера 3.5F в объеме 100 мг/кг. Клиническая и морфологическая картина патологии, развивающейся в результате введения ДНБС, проявляется: потерей веса и диареей с выпадением прямой кишки, кровотечениями, очаговыми изъязвлениями и нейтрофильной инфильтрацией СО кишечника, сглаживанием и уменьшением количества крипт, и во многом сходна с той, что наблюдается при введении ТНБС, что также позволяет сделать вывод о преимущественном использовании ДНБС в моделировании БК, а не ЯК [9, 23].
В литературе имеются данные о широком использовании ДСН, как вещества, способного индуцировать ЯК у мышей, крыс, хомячков и морских свинок [26]. Вещество вводится в рацион экспериментальных животных в виде 3–10 % водного раствора и через 7–10 дней приводит к структурно-функциональным изменениям кишечника, что сопровождается клиническими признаками ЯК: потеря веса, кровавая диарея; и морфологическими признаками ЯК: укорочение ободочной кишки, изъязвление СО, уменьшение числа бокаловидных клеток, крипт и их глубины, инфильтрация лимфоцитами, плазмоцитами и гистоцитами [26]. Модель достаточно проста в исполнении, занимает небольшое количество времени и удобна для изучения вклада врожденных иммунных механизмов в развитие воспалительных изменений стенки кишечника, однако, имеются также недостатки. При пероральном введении ДСН отмечается значительная вариабельность количества вещества, поступившего в желудочно-кишечный тракт, в связи с невозможностью контроля поглощенного животными объема раствора. Вышесказанное обусловливает разнородность повреждений слизистой стенки кишечника по глубине и площади распространения, следствием чего является широкий разброс результатов эксперимента.
Ректальное введение уксусной кислоты (УК) – самый экономически выгодный и простой в исполнении метод экспериментального моделирования ЯК. В литературе описаны различные концентрации и объемы вводимого вещества: 1–2 мл 3–6 % раствора, 5 мл/кг 4 % раствора. Вещество вводится perrectum с помощью полиуретановой трубки для энтерального питания на глубину 6–8 см. Через 24-48 ч от момента введения в стенке толстой кишки наблюдаются следующие изменения: нейтрофильная инфильтрация стенки кишки, массивный некроз слизистого и подслизистого слоя, расширение сосудов, отек подслизистого слоя и изъязвления [14, 16, 17, 22, 33]. Данные изменения наблюдаются также при ЯК. Однако неспецифический характер пускового повреждения СО и невозможность хронизации процесса при использовании УК делают эту модель несовершенной в моделировании ЯК [13, 15, 20, 29, 34]. Также, недостатком применения УК является значительная частота летальных исходов экспериментальных животных в связи с перфорацией стенки кишечника, значительным кровотечением и развитием перитонита.
Каррагинан – высокомолекулярный сульфатированный полисахарид, получаемый из красных водорослей. В зависимости от степени сульфатирования и растворимости подразделяется на три подтипа – каппа, йота, лямбда. Для индукции ВЗК в эксперименте используется лямбда-каррагинан, который включается в рацион крыс в виде 2 % водного раствора в течение 42 дней без предварительной сенсибилизации или в течение 30 дней с предварительной сенсибилизацией путем парентерального введения 1,5 % раствора лямбда-каррагинана [24, 27]. Изменения стенки толстой кишки на момент окончания эксперимента аналогичны тем, что наблюдаются при течении ЯК у человека. Использование лямбда-каррагинана как индуктора экспериментального ЯК отличается простотой в исполнении и отсутствием дискомфорта у животных, постепенным развитием поражений стенки кишечника, что позволяет последовательно оценить динамику морфологических изменений [24]. Однако, как и в модели с использованием ДСН, невозможно создать однородную группу лабораторных животных в связи с различным количеством поступившего в организм вещества у каждого конкретного животного. Также, данная модель занимает продолжительное время.
Альтернативным методом моделирования ЯК является использование вещества 4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-он (оксазолон). Модель двухэтапная: на 1 сутки эксперимента – предварительная сенсибилизация организма путем нанесения на кожу животного 150 мкл 3 % раствора оксазолона (оксазолон в растворе ацетона и оливкового масла в соотношении их 4:1), на 8 сутки эксперимента – ректальное введение 100 мкл 1 % раствора оксазолона в 50 % этиловом спирте [12, 19, 28]. При оценке морфологических изменений на 1–5 сутки после 2 этапа эксперимента в стенке кишечника экспериментальных животных обнаруживаются изменения, сходные с теми, что наблюдаются при ЯК у человека: уменьшение количества бокаловидных клеток и крипт, расширение сосудов, нейтрофильная и лимфоцитарная инфильтрация стенки кишки, отек подслизистого слоя [10]. Преимуществом является доступность, простота в исполнении, быстрота реализации модели. Еженедельное введение малых доз оксазолона вызывает хронизацию ЯК у животных, что более сопоставимо с течением ЯК у человека и позволяет проспективно оценить различные показатели в динамике течения процесса [18].
Выводы
- Основные направления в экспериментальном моделировании ВЗК включают использование генетически модифицированных лабораторных животных и различные методы химической индукции ЯК и БК путем экзогенного введения в пищеварительный тракт веществ – гаптенов иммунологических реакций: тринитробензолсульфоновой кислоты, динитробензолсульфоновой кислоты, декстран сульфата натрия, уксусной кислоты, оксазолона, каррагинана.
- Индукция ВЗК химическими веществами является приоритетной экспериментальной моделью в сравнении с генной инженерией лабораторных животных в связи с экономическим преимуществом, доступностью методов, простотой в исполнении и быстрой реализацией модели.
- Наиболее удобной и удовлетворяющей всем критериям экспериментальной модели ЯК является двухэтапная модель с использованием оксазолона.
- Оптимальной экспериментальной моделью БК является двухэтапная модель с использованием ТНБС.
Библиографическая ссылка
Осиков М.В., Симонян Е.В., Листик Е.В., Бакеева А.Е., Бивалькевич В.А. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА: ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 3. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26524 (дата обращения: 23.01.2025).