Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Сизова Ю.В. 1 Писанов Р.В. 1 Водопьянов А.С. 1 Черепахина И.Я. 1 Бурлакова О.С. 1

---

1 ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора

С появлением генетически измененных вариантов холерных вибрионов возник вопрос о диапазоне вариабельности фенотипических и генотипических проявлений токсинопродукции у типичных и атипичных по генотипу вариантов холерных вибрионов. С учетом актуальности проблемы проведены опыты по оценке влияния стрессовых условий, с которыми вибрионы сталкиваются в окружающей среде, на способность к продукции холерогена. В результате проведенных исследований было показано, что токсигенные холерные вибрионы могут сохраняться в воде открытых водоемов при температуре 220С-240С достаточно продолжительный срок с сохранением продукции холерного токсина, при понижении температуры до 100С и ниже уровни токсинопродукции снижаются вплоть до отрицательных значений. Установлено, что гены ctхAB обнаруживаются в ПЦР до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохраняются живые вибрионы, при этом изменений в популяции клеток вибрионов, связанных с утратой профага CTXφ, а также других значимых участков генома после низкотемпературного стресса в наших экспериментах не отмечено, что подтверждается в полногеномном секвенировании и INDEL-типировании исходных и стрессированных культур и говорит о стабильности генома холерных вибрионов в указанных условиях.

Статья в формате PDF

438 KB

атипичные штаммы

холерный вибрион

токсинопродукция

1. Водопьянов А.С. INDEL-и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н. Мишанькин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Д.А. Зубкова, М.И. Ежова // ЗНиСО. – 2015. – № 5 (266). – С. 41-44.

2. Водопьянов С.О. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру/ С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, Р.В. Писанов, А.Б. Мазрухо // ЗНиСо. – 2011. – № 8. – С.43-45.

3. Заднова С.П. Изменение свойств штаммов холерного вибриона классического биовара под действием факторов внешней среды и мобильных генетических элементов / С.П. Заднова, Н.Д. Исаев, Ю.В. Лозовский, Н.И. Смирнова // Холера и патоген. для чел-ка вибр.: Матер. совещ. и пробл. комис. – Ростов-на-Дону, 2007. – Вып. 20. – С. 102–105.

4. Кульшань Т.А. Сравнительный анализ участков генома, связанных с вирулентностью, у природных штаммов Vibrio cholerae классического и Эль Тор-биоваров / Т.А. Кульшань, Н.Б. Челдышова, Н.П. Гусева, Н.И.Смирнова // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2014. – № 2. – С.26-33.

5. Кульшань Т.А. Оценка функциональных особенностей и стрессоустойчивости изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор / Т.А. Кульшань, С.П. Заднова, Н.Б. Челдышова, Н.И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидем. и иммунобиол. – 2015. – № 3. – С. 11–17.

6. Методические указания (МУ) 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» [Электронный ресурс]. – URL: http://lawru.info/dok/2009/12/22/n229579.htm (дата обращения: 25.04.2017 г.).

7. Миронова Л.В. Анализ стабильности генома Vibrio cholerae в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ / Л.В. Миронова, Ж.Ю. Хунхеева, Е.А. Басов, А.С. Пономарева, С.К. Миткеева, С.В. Балахонов // Проблемы ООИ. – 2016. – № 3. – С.52-56.

8. Писанов Р.В., Симакова Д.И. Роль малых рнк в контроле экспрессии генов, вовлеченных в реализацию патогенности Vibriocholerae / Р.В. Писанов, Д.И. Симакова // Холера и патоген. для чел-ка вибр.: Матер. совещ. и пробл. комис. – Ростов-на-Дону, 2016. – Вып. – С. 136-139.

9. Сизова Ю.В. Влияние температуры на токсинопродукцию холерных вибрионов в речной воде / Ю.В. Сизова, О.С. Бурлакова, И.Я. Черепахина, Л.П. Алексеева, В.В. Евдокимова, Р.В. Писанов, С.О. Водопьянов // ЗНиСО. – 2016. – № 6. – С. 54-56.

10. Смирнова Н.И. Эволюция возбудителя холеры / Н.И. Смирнова, В.В. Кутырев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2004. – 4. – С.3–13.

11. Faruque S.M. Pathogenicity island and phages in Vibrio cholerae evolution / S.M. Faruque, J.J. Mekalanos // Trends. Microdiol. – 2003. – V.11(11). – P.505-510.

12. Iwanaga M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor /M. Iwanaga, K. Yamamoto, N. Higa // Microbiol. Immunol. – 1986. – Vol.30. – Р.1075–83.

13. Mutreja A. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic / A. Mutreja, D.W. Kim, N.R. Thomson, Т.R. Connor et al. // Nature. – 2011. – Р. 462–465.

14. Safa, A. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1 /A. Safa, G.B. Nair, R.Y. Kong // Trends Microbiol. – 2010. – V. 18. – P. 46-54.

15. Zerbino D.R., Birney E. Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs / D.R. Zerbino, E. Birney // Genome Research. – 2008. – Т. 18. – №. 5. – С. 821-829.

С учетом изменений условий существования холерных вибрионов при смене экологической ниши обитания вопрос о стабильности их генома в условиях стресса остается в настоящее время весьма актуальным, особенно в области признаков, касающихся эпидемической значимости возбудителя холеры. Установлено, что вся эволюция V.cholerae обеспечивается присутствием в геноме мобильных генетических элементов: профагов (CTXφ, RS1φ), островов пандемичности (VSP-I и VSP-II) и патогенности (VPI-1 и VPI-2), а также транспозонов и IS-элементов [4,10,13]. Благодаря данным структурам, в конце прошлого столетия появились генетически измененные варианты V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной вирулентностью (так называемые «гибридные» или «атипичные»), несущие в своем геноме ген ctxB1, присущий холерным вибрионам классического биовара. Такие вибрионы с 2001 г. полностью вытеснили типичные штаммы V.cholerae биовара Эль Тор на территории ряда стран Южной Азии (Непал, Индия, Бангладеш, Шри Ланка) и Африки (Мозамбик, Нигерия, Камерун). В 1994 году «атипичные» («гибридные») штаммы вызвали эпидемию холеры в Дагестане, а в 2010–2011 гг. – на о. Гаити [3,10,14]. Однако, несмотря на высокую адаптивную способность холерных вибрионов, не решен вопрос: какие условия требуются для появления и закрепления изменений в геноме возбудителя. Между тем такие сведения крайне необходимы для оптимизации эпидемиологического надзора.

Цель исследования: изучение влияния ряда стрессоров, действию которых вибрионы подвергаются в окружающей среде, на токсинопродукцию.

Материалы и методы: в работе использовали 13 эпидемически значимых штаммов V.cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор (3 – типичные: ctxAB3, rstR^ElTor, 10 – атипичные: ctxAB1, rstR^ElTor) и 2 штамма классического биовара, содержащих гены ctxAB1, rstR^Class.

Для решения поставленных задач холерные вибрионы инкубировали в стерильной речной воде (конечная концентрация 1*10⁷ м.к./мл) при +4⁰С и при +22⁰С в течение нескольких месяцев, а также (при моделировании условий пребывания возбудителя холеры в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время) эксперимент продолжали 2 месяца при 22 ⁰С, 2 месяца – при 10 ⁰С, 5 месяцев – при 4 ⁰С при сниженном содержании кислорода (в речной воде оно составляет около 1 %). Ежемесячно производили высевы на агар Мартена для определения выживаемости холерных вибрионов. Выжившие в условиях стресса клетки культивировали по методике М. Iwanaga [12] для определения продукции холерогена в супернатантах в GM₁-ИФА с антитоксической сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов по специально разработанной нами схеме, в рабочем разведении 1х20000. Результаты оценивали при титрации супернатантов по следующей схеме: низкий уровень токсинопродукции – титр в GM₁-ИФА 1/2-1/20, средний уровень – 1/40-1/320, высокий уровень – 1/640-1/2560.

Выделение бактериальной ДНК из клеток V. cholerae проводили, согласно МУ 1.3.2569-09 [6]. Полученные образцы, содержащие тотальную ДНК холерного вибриона, использовали для амплификации фрагментов генов. Наличие гена ctxAB определяли в ПЦР[2]. Секвенирование геномной ДНК выполнялись на платформе MiSeq (Illumina). Пробоподготовку проводили согласно протоколам производителя. Сборку контигов осуществляли с помощью программы Velvet [15]. Биоинформационный анализ проводили с помощью программ GeneExpert и SeqAnalyzer, разработанных во ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора с использованием ресурсов геномной базы данных NCBI.INDEL-типирование проводили по методике, предложенной А.С. Водопьяновым [1].

Результаты и обсуждение. Как нами было показано ранее [9], у холерных вибрионов при +4ºС в речной воде в течение первых 14 дней имеет место некоторое увеличение показателей токсинопродукции у большей части исследуемых штаммов (за исключением штаммов V.cholerae 1601 и 17427 – у них отмечалось незначительное снижение титра, и штаммов 569, 1310, 19188, у которых уровень продукции оставался без изменений). Однако уже через месяц стрессового воздействия показатели токсинообразования резко снижались, вплоть до полного исчезновения фенотипического проявления признака к концу второго месяца. Только три штамма V.cholerae ElTor сохраняли способность к токсинопродукции, определяемой методом ИФА: высокотоксигенный типичный 1310, типичный 3119 и атипичный 19667, выделенный от больного в Москве в 2014 г. Остальные 10 штаммов перестали продуцировать холероген, при сохранении генов ctxАВ, определяемых в ПЦР. Через три месяца низкотемпературного стресса ни одна из культур не выросла в среде AKI, показатели токсинопродукции были отрицательными, гены ctxAB в ПЦР не обнаружены.

Обращает на себя внимание, что реакция на стрессовое воздействие разных температур, имитирующих условия пребывания холерных вибрионов в речной воде, отличалась у типичных и атипичных вариантов. Так, средние показатели токсинопродукции при холодовом стрессе (4°С) у атипичных вариантов были выше только в первые две недели (рис. 1), затем уровень холерогена у них снижался интенсивнее, чем у типичных штаммов (показания высокотоксигенного исходного мутантного штамма 1310 в расчет не принимались), т.е. они были более чувствительны к низким температурам, чем типичные.

Рис. 1. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при 4°С

Напротив, в отсутствие температурного стресса (22°С) средние показатели токсинопродукции у атипичных вариантов вибрионов Эль Тор на всем протяжении исследования были в 2–8 раз выше, чем у типичных штаммов, что в полной мере характеризует их, как варианты с повышенной вирулентностью (рис. 2).

Рис. 2. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при 22°С

Рис. 3. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при постепенной смене температур

При моделировании условий пребывания холерных вибрионов в водоемах Российской Федерации, в которых на протяжении эпидемического сезона температура постепенно снижается, токсинопродукция к 5 месяцу инкубации практически отсутствовала, но на протяжении 4 летне-осенних месяцев при 22°С и 10°С она в среднем в 2–4 раза была выше у атипичных вариантов (рис. 3), что необходимо учитывать при проведении эпиднадзора за холерой. Проведенные исследования показали, что фенотип возбудителя холеры в части токсинопродукции выраженно «отвечает» на стрессовые воздействия окружающей среды.

Что касается структуры генома, то в эксперименте Т.А. Кульшань с соавторами была показана возможность утраты генов профага СТХφ, в том случае, когда исследуемые «типичные» штаммы холерных вибрионов несли одну копию профага, в то время как атипичные «гибридные» геноварианты с двумя копиями профага СТХφ сохраняли указанные гены [5]. В наших опытах в ПЦР отмечено сохранение генов патогенности вне зависимости от отрицательных показателей ИФА, до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохранялись живые вибрионы. В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V.cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживались.

В свете полученных данных представляло интерес сравнить геномы исходных и стрессированных вариантов холерных вибрионов, для чего было проведено полногеномное секвенирование 3 штаммов, а также сравнение их INDEL-профилей по 9 локусам (табл.1,2).

В таблице 1 представлены результаты сиквенса, выраженные в процентах совпадения с референс-последовательностью.

Таблица 1

Результаты полногеномного секвенирования исходных и стрессированных культур холерных вибрионов

Как видно из таблицы, полногеномное секвенирование стрессированных культур не выявило полиморфизма структуры генома в сравнении с исходными штаммами по основным наборам генов.

В связи с тем, что в литературе есть сведения об изменениях VNTR-профиля холерных вибрионов на начальном этапе стрессового воздействия у отдельных штаммов, которые рассматриваются авторами как первичная реакция на стресс [7], вероятно, следует учитывать их при анализе результатов молекулярного типирования вибрионов, выделенных в рамках проведения мониторинга при эпидемиологическом надзоре за холерой. В связи с этим возникала необходимость выбора более стабильного метода типирования выделяемых штаммов холерных вибрионов, в том числе разработанного А.С. Водопьяновым INDEL-типирование [1]. Проведение INDEL-типирования исследуемых штаммов по 9 локусам показало, что все изученные стрессированные культуры сохранили свой INDEL-профиль без изменений (табл. 2).

Таблица 2

Результаты INDEL-типирования исходных и стрессированных культур холерных вибрионов

Выводы. Таким образом, токсигенные холерные вибрионы могут персистировать в воде открытых водоемов при температуре 22°С-24°С достаточно продолжительный срок с сохранением продукции холерного токсина, т.е. оставаясь эпидемически значимыми; при понижении температуры до 10°С и ниже уровни токсинопродукции снижаются вплоть до отрицательных значений, а низкая температура как стрессор, имитирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, возможно, ингибирует активацию белка ToxT, ответственного за транскрипцию генов, кодирующий холерный токсин, уже в первый месяц. Установлено, что, вне зависимости от отрицательных показателей ИФА, гены ctхAB обнаруживаются в ПЦР до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохраняются живые вибрионы. В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V.cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживаются. Изменений в популяции клеток вибрионов, выживших после низкотемпературного стресса, связанных с утратой профага CTXφ, несущего гены, ответственные за синтез холерного токсина, а также утратой других значимых участков генома, в наших экспериментах не отмечено, что подтверждается в полногеномном секвенировании INDEL-типировании исходных и стрессированных культур и говорит о его стабильности. Возможно, изменение токсинопродукции в стрессовых условиях связано не с реорганизацией генома, а с изменением экспрессии каскада регуляторных генов ToxR-S, ToxT, регуляция которых находится в непосредственной зависимости от состояния кворум сенсинга бактериальной культуры V.cholerae и управляется четырьмя малыми РНК, получившими название Qrr1-4 [8]. Возможно, регуляторная система малых РНК позволяет V.cholerae сохранять гены патогенности в стрессовых условиях, что и является предметом наших дальнейших исследований.

Библиографическая ссылка