Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Рецензия
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Авдеева Н.В. 1 Покровский М.В. 1 Корокин М.В. 1

---

1 ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Исследование проводилось на базе центра доклинических исследований Белгородского государственного национального исследовательского университета. В ходе исследования проведено выявление и количественная оценка щелоче-лабильных сайтов и разрывов ДНК в лейкоцитах периферической крови мышей-самцов. В основе данного метода лежит оценка целостности ДНК в лейкоцитах цельной крови животных. Для анализа использовали периферическую кровь мышей. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали показатель %TDNA - %ДНК в хвосте «кометы». А также изучалась цитогенетическая активность лекарственного средства «Рапиталам» с помощью микроядерного теста в полихроматомных эритроцитах костного мозга. Работа проводилась на мышах in vivo. Рапиталам вводился животным в соответствии с двумя схемами: однократно в субтоксической дозе (1/5 от полулетальной дозы, равной 413 мг/кг) и 4 дня внутрижелудочного введения терапевтической дозы 3 мг/кг. Группе негативного контроля вводили по 0.3 мл 5% раствора диметилсульфооксида, а в качестве позитивного контроля животных облучали в дозе 20 сГр рентгеновского излучения, обладающего известным цитогенетическим действием. Цитогенетическое повреждение клеток костного мозга оценивалось по появлению полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра. В результате данного исследования установлено, что уровень повреждений ДНК лейкоцитов крови (%TDNA) в группах при острой дозе препарата Рапиталам статистически достоверно отличается от таковых значений в контрольной группе животных, что свидетельствует о наличии ДНК-повреждающей активности у препарата Рапиталам в острой дозе. Анализ уровня повреждений ДНК лейкоцитов крови (%TDNA) в группах животных, получавших терапевтическую дозу субстанции Рапиталам, показал достоверные различия между животными, получавшими растворитель (диметилсульфоксид), и животными, получавшими растворенный в диметилсульфооксиде Рапиталам. Обращает на себя внимание тот факт, что для терапевтической дозы наблюдается существенное снижение уровня повреждений в ДНК как по сравнению с острой дозой, так и группами, получавшими только растворитель. Это позволяет сделать предположение о том, что препарат Рапиталам в терапевтической дозе может оказывать влияние на процессы внутриклеточного метаболизма и выступать в качестве протектора. В результате проведенных исследований не было выявлено цитогенетической активности препарата Рапиталам в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при однократном в субтоксической дозе и 4-дневном в терапевтической дозе пероральном введении животным.

Рецензия № 1

2237 KB

Рецензия № 2

1330 KB

Статья в формате PDF

171 KB

полихроматофильные эритроциты костного мозга

микроядерный тест

модуляторы mglur4 рецепторов. цитогенетической активности рапиталама

метаботропные глутаматные рецепторы

болезнь Паркинсона

рапиталам

разрыв днк в лейкоцитах

щелоче-лабильные сайты.

1. ГОСТ 31886-2012. Принципы надлежащей лабораторной практики [Электронный ресурс]. – URL: http://docs.cntd.ru/document/1200101144.

2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: часть первая / А.Н. Миронов, Н.Д. Бунатян и др. - М.: Гриф и К, 2012. – 944 с.

3. Avdeeva N.V., Nikitina V.A., Kochkarova I.S., Litvinova A.S. The possibility of administration of glutamate receptors antagonists in the treatment of parkinson's disease // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2016. – Vol. 2, №3. – P. 86-94.

4. Avdeeva N.V., Kulikov A.L., Pokrovskii M.V., Avtina T.V. Pharmacokinetic studies of new antiparkinsonian drug Rapitalam // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2016. – Vol. 2, №4. – P. 3-8.

5. Chen J.J., Swope D.M. Pharmacotherapy for Parkinson’s disease // Pharmacotherapy. – 2007. - № 27. – Р. 161-173.

6. Conn P.J., Battaglia G., Marino M.J., Nicoletti F. Metabotropic glutamate receptors [in the basal ganglia motor circuit] // Nat Rev Neurosci. – 2005. - № 6 (10). – Р. 787-798.

7. Guide for the care and use of laboratory animals // Washington D.C.: National Academy press, 2011 [Электронный ресурс]. – URL: https://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-Laboratory-animals.pdf.

8. Karaban I.N. Use of Glutamate Receptor Blocker Amantadine in Neurology // International neurological journal. – 2012. – № 2. – Р. 195-201.

9. Kari A. Johnson, P. Jeffrey Conn, Collen M. Niswender «Glutamate receptors as therapeutic targets for Parkinson’s disease» // CNS Neurol Disord Drug Targets. – 2009. - № 8 (6). – Р. 475-491.

10. Kravchenko D.V., Avdeeva N.V., Korokin M.V. Assessment of the DNA damage level in peripheral blood leukocytes of mice treated orally with Rapitalam in acute and therapeutic doses // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2016. – Vol. 2, №4. – P. 9-11.

11. Olanow C.W., Stern M.B., Sethi K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson’s disease // Neurology. – 2009. - V. 72. - Р. 149.

Основными признаками болезни Паркинсона, нейродегенеративного заболевания головного мозга, являются нарушение координации движений, скованность и замедленность при ходьбе, тремор рук, ног, подбородка. Чаще всего болезнь Паркинсона поражает людей пожилого возраста [3]. Ее развитие напрямую обусловлено гибелью нейронов, которые несут ответственность за выработку дофамина. Вначале этот процесс происходит в черной субстанции, а затем затрагивает и прочие отделы центральной нервной системы. Основным подходом в лечении болезни Паркинсона в настоящее время является заместительная терапия дофамина. Однако препараты леводопы не замедляют продолжающуюся дегенерацию дофаминергических нейронов, функциональная активность которых обуславливает превращение леводопы в дофамин под действием дофа-декарбоксилазы. Также препараты леводопы имеют достаточно большое количество побочных эффектов, а со временем дозировка должна увеличиваться, иначе они перестают действовать [11]. Поэтому перед лечащим врачом пациента, страдающего болезнью Паркинсона, стоят две основные задачи: приостановить отмирание ганглий, содержащих дофамин, и уменьшить проявление симптомов болезни [5]. Прогресс в понимании анатомии и функции базальных ганглиев дал возможность для разработки новых препаратов для лечения и замедления прогрессирования болезни Паркинсона [9]. Хотя болезнь Паркинсона и пытаются лечить, специалистам удается лишь частично устранить ее симптомы, но не саму причину. Сегодня все усилия ученых направлены на поиски лекарственных средств, которые не только смягчают симптомы болезни, но и останавливают дегенеративные процессы, ответственные за ее прогрессирование. Так, рецепторы глутомата были предложены в качестве перспективных терапевтических мишеней, поскольку воздействие на них позволяет менять как нормальную, так и патологическую нейротрансмиссию, характерную для паркинсонического мозга.

Рапиталам является модулятором mglur4 рецепторов [8]. Mglur4 это разновидность метаботропных рецепторов глутамата [10]. Рецепторы глутамата играют огромную роль в регуляции функционирования и развития нервной системы. Например, глутамат играет роль в гибели нейронов в условиях гипоксии – в таких условиях транспортёр глутамата не способен осуществлять обратный захват нейромедиатора в клетку. Поэтому при массовой гибели нервных клеток количество высвободившегося глутамата растёт в геометрической прогрессии, вызывая эксайтотоксичное возбуждение в ещё живых нейронах, которые тоже могут умереть из-за этого. Глутаматэргическая система мозга – это одна из самых широкоспециализированных сигнальных систем в нашем мозге и нервной системе, и её роль действительно сложно переоценить [9]. Вышеизложенные данные указывают на целесообразность доклинического изучения Рапиталама, модулятора mGluR4 рецепторов, для создания на его основе лекарственного средства, обладающего антипаркинсоническим действием [4].

Цель исследования

Выявление и количественная оценка щелоче-лабильных сайтов и разрывов ДНК в лейкоцитах периферической крови мышей-самцов, а также потенциальной цитогенетической активности фармацевтической субстанции препарата Рапиталам в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей.

Материалы и методы

Эксперименты проводились на самцах нелинейных мышей популяции SHK весом 24-28 г. Источник животных – виварий Белгородского государственного университета. Уход и содержание животных производился в соответствии с нормативами, данными в руководстве [7], и правилами [1]. Время адаптации составило 10-14 дней. Животные содержались в условиях центра доклинических исследований НИУ БелГУ, на стандартной диете, при 12-часовом световом режиме, в условиях свободного доступа к воде и пище. В каждой экспериментальной и контрольной группе было по 6 рандомизированно распределенных животных. В качестве негативного контроля использовали животных, которым вводился растворитель. В этой серии эксперимента исследовали вещество Рапиталам (формула - С₂₀Н₁₈ClN₃O₃, химическое название - N-​[(4-​chlorophenyl)​methyl]​-​1,​6-​dihydro-​4-​methoxy-​1-​(2-​methylphenyl)​-​6-​oxo-3-​pyridazinecarboxamid​e) при однократном (субтоксической) и 4-дневном пероральном введении терапевтической для человека доз. Субтоксическая доза рассчитывалась как 1/5 от полулетальной дозы, равной 413 мг/кг. Терапевтическая доза рассчитывалась из концентрации 3 мг/кг, которая была выявлена в более ранних исследованиях по фармакокинетике. Исследуемое соединение – фармацевтическая субстанция препарата Рапиталам - растворяли в диметилсульфоксиде до конечной концентрации растворителя 5%.

Для оценки целостности ДНК в лейкоцитах цельной крови животных использовали периферическую кровь мышей, получаемую при надрезании кончика хвоста. Взятие аликвот крови (10 мкл) у каждого животного проводилось не позднее 24 ч после завершения приема препарата. Периферическую кровь отбирали в пробирки, содержащие фосфатный буфер (136.7 мM NaCl, 2.7 мM KCl, 8.1 мM Na₂HPO₄, 1.5 мM KH₂PO₄, рН 7.2-7.4) и 1 мМ ЭДТА, перемешивали на вортексе для предотвращения свертывания и сразу же использовали для приготовления агарозных слайдов [10].

Аликвоты разведенной крови смешивали с равным объемом 1%-ной легкоплавкой агарозы (Sigma Chem. Co., США) при температуре 37 ºС и наносили на приготовленный агарозный слой. После застывания агарозы, содержащей клетки, сверху наносили новый слой 0.5%-ной легкоплавкой агарозы. Слайды помещали в лизирующий раствор (2.5 моль/л NаС1, 0.1 моль/л ЭДТА, 0.01 моль/л трис-НСl, рН 10, 1% Тритон Х-100) при 4-6 °С на 1 ч. Затем слайды перемещали на 20 мин в щелочной раствор (0.3 моль/л NаОН, 0.001 моль/л ЭДТА, рН >13), переносили в электрофоретическую камеру SE-1/S-1N (ООО «Компания Хеликон», Россия) и подвергали электрофорезу в свежей порции щелочного раствора (250 мл) в течение 20 мин при 4-6 °С (напряжение 27 В, сила тока 260-270 мА, напряженность электрического поля 2 В/см).

После электрофореза слайды промывали дистиллированной водой и окрашивали в течение 1 ч в растворе, содержащем 2.0 мкг/мл бромистого этидия. Препараты анализировали, используя флуоресцентный микроскоп «ЛЮМАМ И-3» («ЛОМО», Санкт-Петербург, Россия). Захват изображений проводили цифровым фотоаппаратом Nikon CoolPix 995 (Япония) с последующей передачей их в компьютер. Обработку микрофотографий выполняли с помощью специализированного программного обеспечения, где реализованы алгоритмы расчета стандартных параметров «комет». На каждую экспериментальную точку брали по 6 мышей, готовили по 3 слайда с цельной кровью от каждого животного и фотографировали по 50 «комет» на слайде, то есть на каждый микропрепарат рандомизированно анализировали не менее 150 ДНК-комет без наложений хвостов. Анализ параметров ДНК-комет проводился с сохраненных цифровых изображений. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали показатель %TDNA - % ДНК в хвосте «кометы». Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента (p < 0.05). Средние значения представлены как M ± SD.

Метод определения цитогенетической активности фармацевтической субстанции препарата Рапиталам в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. В экспериментальной группе каждому животному вводили перорально по 0.3 мл раствора вещества, группе негативного контроля вводили по 0.3 мл 5% раствора диметилсульфоксида, а в качестве позитивного контроля животных облучали в дозе 20 сГр рентгеновского излучения, обладающего известным цитогенетическим действием. В ходе исследования оценивалось цитогенетическое повреждение клеток костного мозга по появлению полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра. Эвтаназию мышей проводили декапитацией через 24 ч после введения исследуемого вещества и облучения. По стандартной методике, рекомендованной в соответствующих руководствах, готовили цитологические препараты костного мозга [1]. Препараты окрашивали краской Гимза по Романовскому. Подсчет полихроматофильных эритроцитов с микроядрами осуществляли при помощи светового микроскопа с иммерсионным объективом при увеличении в 1000 раз. На каждую экспериментальную точку использовали 6 животных, анализировали по 3 препарата от одной мыши по 1000 полихроматофильных эритроцитов в каждом препарате. Критерием уровня цитогенетического повреждения служил процент клеток с микроядрами. При статистической обработке вычисляли стандартную ошибку среднего, а статистическую значимость между группами оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты

Данные о показателях ДНК-повреждений для индивидуальных мышей, определенных после приема исследуемого вещества Рапиталам и/или 5% раствора диметилсульфоксида (ДМСО), приведены в таблицах 1 и 2. В таблице 3 приведены средние показатели ДНК-повреждений по группам при приеме препарата и/или растворителя для этого препарата.

Таблица 1

Уровень ДНК-повреждений в клетках периферической крови животных при приеме ДМСО и/или субстанции Рапиталам в острой дозе (M ± SD)

Примечание: нет достоверных различий между значениями %TDNA для ДМСО и субстанции Рапиталам у индивидуальных животных.

Таблица 2

Уровень ДНК-повреждений в клетках периферической крови животных при приеме ДМСО и/или субстанции Рапиталам в терапевтической дозе (M ± SD)

Примечание: * - достоверно отличается от значения %TDNA для ДМСО (р < 0,05).

Таблица 3

Влияние субстанции Рапиталам на уровень повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови мышей (M ± SD)

Примечание: различия между значениями %TDNA для ДМСО и субстанции Рапиталам как в острой дозе, так и в терапевтической дозе достоверны;

* - достоверно отличается от значения %TDNA для острой дозы субстанции Рапиталам (р < 0,05).

Обращает на себя внимание тот факт, что для терапевтической дозы наблюдается существенное снижение уровня повреждений в ДНК как по сравнению с острой дозой, так и группами, получавшими только растворитель. Это позволяет сделать предположение о том, что субстанция Рапиталам в терапевтической дозе может оказывать влияние на процессы внутриклеточного метаболизма и выступать в качестве протектора.

Основные показатели влияния Рапиталама на выход полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (ПХЭ с МЯ) в костном мозге мышей при однократном и 4-дневном пероральном вариантах воздействия представлены в таблице 4.

Таблица 4

Выход полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (ПХЭ с МЯ) в костном мозге мышей при однократном и 4-дневном пероральном вариантах

В результате проведенных исследований не было выявлено цитогенетической активности субстанции Рапиталам в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при однократном в субтоксической дозе и 4-дневном в терапевтической дозе пероральном введении животным. Значения количества полихроматофильных эритроцитов с микроядрами не отличались достоверно от необработанного контроля и контроля растворителя, достоверное различие наблюдалось при облучении в дозе 20 сГр рентгеновского излучения (позитивный контроль).

Выводы

1. Анализ уровня повреждений ДНК лейкоцитов крови (%TDNA) в группах при острой дозе вещества Рапиталам (табл. 3) показал достоверные различия между животными, получавшими растворитель, и мышами, получавшими растворенный в ДМСО препарат Рапиталам (р = 0,008). Это свидетельствует о наличии ДНК-повреждающей активности у Рапиталама в острой дозе.
2. Анализ уровня повреждений ДНК лейкоцитов крови (%TDNA) в группах при терапевтической дозе субстанции Рапиталам показал достоверные различия между животными, получавшими растворитель, и животными, получавшими растворенное в ДМСО вещество Рапиталам (р = 0,0009) (табл. 3).
3. Анализ цитогенетической активности Рапиталама в полихроматофильных эритроцитах костного мозга показал отсутствие таковой как при проведении исследования на мышах при однократном введении в субтоксической дозе и при 4-дневном пероральном введении в терапевтической дозе.
4. Субстанция Рапиталам статистически значимо не влияет на количество полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге.

Библиографическая ссылка