Болезнь Паркинсона – хроническое нейродегенеративное заболевание, в основе которого лежит прогрессирующее разрушение и гибель нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин [11]. Недостаточная выработка дофамина ведет к активирующему влиянию базальных ганглиев на кору головного мозга [5]. Ведущими симптомами являются: мышечная ригидность, гипокинезия, тремор, постуральная неустойчивость. Современная медицина пока не нашла методов излечения данной патологии, однако современные методы консервативного и оперативного лечения позволяют значительно улучшить качество жизни больных и замедлить прогрессирование болезни. Существуют данные о ключевой роли гиперактивации глутаматных рецепторов в патогенезе болезни Паркинсона. Это позволяет предположить, что глутаматные рецепторы могут быть новыми терапевтическими мишенями при лечении данной патологии [3]. Изучение блокаторов глутаматных рецепторов является важной задачей при поиске новых фармакологических средств для лечения болезни Паркинсона. Исследования, проведенные на животных моделях, позволяют предположить, что изменение активности этих рецепторов может облегчить первичные двигательные симптомы болезни Паркинсона, а также побочные эффекты, вызванные заместительной терапией леводопы. Антагонисты АМРА- NMDA-рецепторов показали возможность реверсировать двигательную симптоматику и леводопа-индуцированные дискинезии в доклинических моделях болезни Паркинсона [10]. Антагонисты метаботропных рецепторов глутамата являются еще более перспективными для лечения болезни Паркинсона благодаря более «точной» работе в синапсе [3]. Эти препараты также реверсируют двигательный дефицит и способствуют торможению нейродегенерации. Таким образом, рецепторы глутамата представляют собой перспективные цели для разработки новых фармакологических методов лечения болезни Паркинсона.
Доклиническое изучение модулятора mGluR4 рецепторов – Рапиталама представляется перспективным для создания на его основе лекарственного средства, обладающего антипаркинсоническим эффектом.
Целью исследования: изучить органное распределение и экскрецию блокатора mGluR4 рецепторов – Рапиталама у крыс.
Материалы и методы исследования
Определение концентрации Рапиталама в биообразцах крыс проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоселективным и чувствительным тандемным масс-спектрометрическим детектированием [7; 8]. Анализ проводился на жидкостном хроматографе Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RS, оснащенном термостатируемым автоматическим дозатором, вакуумным дегазатором, градиентным насосом, термостатом колонок. Детекцию аналита осуществляли на масс-спектрометре VelosPro (ThermoScientific, США) с ионизацией в нагреваемом электроспрее (H-ESI-II).
Параметры работы аналитической системы
Хроматографическое разделение осуществляли на колонке размером 150 × 2,1 мм, заполненной обращённо-фазовым сорбентом ZorbaxEclipce XDB C18 с размером частиц 3,0 мкм с защитной колонкой ZorbaxEclipce XDB C18 12,5×3,0 мм с размером частиц 5,0 мкм, при температуре 40 °С в режиме изократического разделения со скоростью потока 0,3 мл/мин. Объем вводимой пробы – 5 мкл. Ориентировочные времена удерживания при указанных условиях: Рапиталама – около 7 мин; внутренний стандарт (фабомотизол) – около 2,1 мин. Время инжекции – 7,0 мин. Ионизацию проводили при помощи H-ESI в режиме «+». Сканирование осуществляли по селективно выбранным ионам (SIM). Переход масс для Рапиталам:: 383,84→367,0, внутренний стандарт: 244,7→130,94. Напряжение на источнике 3000 V. Температура источника 300 °C. Остальные параметры в соответствии с автоматической оптимизацией прибора.
Крысы – общепринятый вид животных для изучения экскреции и распределения в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [2]. В исследование включено 18 крыс (самцы весом 330-380 г). Источник животных – питомник Белгородского государственного университета. Время адаптации составило не менее 10 дней. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В исследование были отобраны животные без признаков отклонений внешнего вида, животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы включены не были. Крыс содержали по 6 голов в поликарбонатных клетках. Уход и содержание животных производили в соответствии с нормативами, данными в руководстве Guide for the care and use of laboratory animals. The National Academy press. – Washington D.C., 2011 [6], и правилам, утвержденным ГОСТ 31886-2012 «Принципы надлежащей лабораторной практики» [1].
Выведение исследуемого вещества изучали на 6 крысах-самцах. Рапиталам вводили однократно внутрижелудочно при помощи зонда в дозе 60 мг/кг в виде 60 мг/мл суспензии в воде. Для забора мочи и кала использовали метаболические клетки (Techniplast, Италия). Исследовали экскрецию препарата с мочой и калом в интервалах времени: 0-4, 4-8, 8-24 ч.
Органное распределение вещества изучали на 12 крысах-самцах после однократного внутрижелудочного введения Рапиталама животным в дозе 60 мг/кг. Были собраны цельная кровь, плазма, тимус, печень, головной мозг, почки, сердце, легкие, кровь, кишечник, селезенка, кожа, мышцы, жировая ткань.
Пробоподготовка: анализируемый орган и кал за отчетный период взвешивали, помещали в контейнер, прибавляли аликвоту воды в количестве эквивалентном массе, замораживали при -70 ºС и в твёрдом агрегатном состоянии гомогенизировали. Мочу использовали без предварительной обработки. Далее проводили извлечение определяемого вещества в жидкую фазу гомогената путём обработки ультразвуком в течение 30 минут (финальный гомогенат). 200 мкл финального гомогената или мочи переносили в пробирку типа «эппендорф» вместимостью 1,5 мл, добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта, перемешивали, прибавляли 0,5 мл МеОН, встряхивали на шейкере 15 минут. Далее проводили экстракцию определяемого вещества на ультразвуковой бане в течение 30 минут. Затем пробы центрифугировали при 13 000 об/мин и температуре 4 ºС 25–30 минут (для кала и органов соответственно). Супернатант аккуратно декантировали в виалы для хроматографирования и анализировали.
В качестве плацебо для построения калибровочной кривой и в растворах контроля качества использовали нулевые гомогенаты органов, кала и нулевой мочи крыс. Также нулевые гомогенаты органов, кала и нулевой мочи использовали для подтверждения селективности методики. Для подтверждения достоверности полученных результатов растворы контроля качества анализировали в процессе исследования и находили погрешности между введенным и найденным количеством определяемого вещества и затем сравнивали с допустимыми пределами.
В специализированной программе Xcalibur 2.2 рассчитывали площади пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта, далее данные переносили в пакет Microsoft Office Excel 2010, где рассчитывали уравнение калибровочной кривой, статистически оценивали отклонения, графически отображали результаты. Концентрации Рапиталама в исследуемых объектах рассчитывали в программе Microsoft Office Excel 2010 по калибровочным кривым.
Выбросы (резко выделяющиеся результаты) у крыс в каждой временной точке выявляли с помощью статистического критерия Граббса [9]. Если для какого-либо образца величина Z была больше критического значения для данного числа измерений N, этот образец исключали из дальнейших расчетов изучаемых параметров. Так, для N=6 критическое значение Z равно 1,89, поэтому пробы с Z>1,89 считались выбросами [4].
Результаты исследований
Распределение Рапиталама изучали после однократного внутрижелудочного введения крысам в дозе 60 мг/кг. В таблице 1 представлены результаты определения содержания Рапиталама в исследованных органах и тканях. Расчёт кажущегося коэффициента распределения (Кd) между плазмой и тканями представлен в таблице 2.
Таблица 1
Концентрация Рапиталама в органах крыс
|
№ |
Концентрация, мкг/г |
||||||||||||
|
Легкие |
Сердце |
Кожа |
Мышечная ткань |
Почки |
Печень |
Жировая ткань |
Тимус |
Селе- зёнка |
Тонкий кишечник |
Мозг |
Подже- лудочная железа |
Плазма |
|
|
1 |
0,042 |
0,520 |
0,081 |
1,732 |
0,053 |
9,333 |
2,062 |
0,024 |
0,109 |
4,328 |
20,299 |
0,044 |
15,956 |
|
2 |
0,039 |
0,577 |
0,063 |
1,778 |
0,045 |
7,742 |
2,579 |
0,017 |
0,071 |
5,062 |
16,481 |
0,065 |
20,458 |
|
3 |
0,038 |
0,578 |
0,053 |
2,064 |
0,035 |
8,347 |
3,035 |
0,024 |
0,068 |
5,231 |
18,390 |
0,090 |
19,605 |
|
4 |
0,047 |
0,592 |
0,061 |
2,078 |
0,055 |
7,586 |
2,057 |
0,045 |
0,086 |
4,656 |
11,612 |
0,078 |
17,867 |
|
5 |
0,035 |
0,684 |
0,081 |
2,025 |
0,048 |
11,714 |
2,786 |
0,033 |
0,074 |
3,860 |
13,719 |
0,056 |
14,713 |
|
6 |
0,023 |
0,858 |
0,042 |
2,547 |
0,036 |
11,756 |
3,202 |
0,054 |
0,076 |
3,210 |
15,922 |
0,059 |
17,905 |
|
Среднее |
0,037 |
0,635 |
0,064 |
2,038 |
0,045 |
9,413 |
2,620 |
0,033 |
0,081 |
4,391 |
16,071 |
0,065 |
17,751 |
|
СV,% |
21,6 |
19,1 |
24,2 |
14,3 |
18,7 |
20,2 |
18,4 |
43,6 |
18,7 |
17,4 |
19,5 |
25,2 |
12,1 |
|
Медиана |
0,039 |
0,585 |
0,062 |
2,045 |
0,046 |
8,840 |
2,682 |
0,028 |
0,075 |
4,492 |
16,202 |
0,062 |
17,886 |
Таблица 2
Расчёт Kd Рапиталама
|
№ |
D – 30 мг/кг |
|||||||||||
|
Легкие |
Сердце |
Кожа |
Мышечная ткань |
Почки |
Печень |
Жировая ткань |
Тимус |
Селе- зёнка |
Тонкий кишечник |
Мозг |
Подже- лудочная железа |
|
|
1 |
0,003 |
0,033 |
0,005 |
0,109 |
0,003 |
0,585 |
0,129 |
0,001 |
0,007 |
0,271 |
1,272 |
0,003 |
|
2 |
0,002 |
0,028 |
0,003 |
0,087 |
0,002 |
0,378 |
0,126 |
0,001 |
0,003 |
0,247 |
0,806 |
0,003 |
|
3 |
0,002 |
0,029 |
0,003 |
0,105 |
0,002 |
0,426 |
0,155 |
0,001 |
0,003 |
0,267 |
0,938 |
0,005 |
|
4 |
0,003 |
0,033 |
0,003 |
0,116 |
0,003 |
0,425 |
0,115 |
0,003 |
0,005 |
0,261 |
0,650 |
0,004 |
|
5 |
0,002 |
0,046 |
0,005 |
0,138 |
0,003 |
0,796 |
0,189 |
0,002 |
0,005 |
0,262 |
0,932 |
0,004 |
|
6 |
0,001 |
0,048 |
0,002 |
0,142 |
0,002 |
0,657 |
0,179 |
0,003 |
0,004 |
0,179 |
0,889 |
0,003 |
|
Среднее |
0,002 |
0,036 |
0,004 |
0,116 |
0,003 |
0,544 |
0,149 |
0,002 |
0,005 |
0,248 |
0,915 |
0,004 |
|
СV,% |
24,4 |
23,8 |
35,0 |
18,0 |
26,7 |
30,0 |
20,4 |
44,7 |
26,9 |
13,9 |
22,5 |
19,6 |
|
Медиана |
0,002 |
0,033 |
0,003 |
0,112 |
0,003 |
0,505 |
0,142 |
0,002 |
0,005 |
0,261 |
0,911 |
0,004 |
Как видно из приведенных результатов, препарат хорошо распределяется в органы. Наибольшее содержание наблюдалось в тканях мозга, печени, тонкого кишечника, жировой ткани, мышцах и сердце. Наименьшее содержание наблюдалось в легких, коже, почках, тимусе, селезёнке, поджелудочной железе.
Экскрецию Рапиталама изучали после однократного внутрижелудочного введения препарата крысам в дозе 60 мг/кг. В таблице 3 представлен расчёт общего клиренса. В таблице 4 представлены результаты по выведению Рапиталама из организма крыс. Определено общее содержание препарата в моче и кале крыс.
Таблица 3
Содержание Рапиталама в моче крыс и почечный клиренс при однократном внутрижелудочном введении в дозе 60 мг/кг
|
№ животного |
Время, ч |
Общее кол-во (0-24 ч), мкг |
Процент от дозы, %*кг |
AUC , мин*мкг/мл |
Cl renal, мл/мин |
|||
|
0-4 |
4-8 |
8-24 |
24-48 |
|||||
|
1 |
0,206 |
0,643 |
166,450 |
269,988 |
437,287 |
2,429 |
3459,744 |
0,126 |
|
2 |
0,508 |
0,742 |
154.76 |
258,760 |
260,010 |
1,445 |
3234,632 |
0,080 |
|
3 |
0,364 |
0.735 |
187,489 |
260,432 |
448,285 |
2,490 |
3032,789 |
0,148 |
|
4 |
0,444 |
0,688 |
145,567 |
279,567 |
426,266 |
2,368 |
3677,985 |
0,116 |
|
5 |
0,436 |
0,701 |
188,986 |
278,455 |
468,578 |
2,603 |
3544,748 |
0,132 |
|
6 |
0,548 |
0,598 |
169,754 |
288,340 |
459,240 |
2,551 |
3654,432 |
0,126 |
|
Среднее |
0,418 |
0,674 |
171,649 |
272,590 |
416,611 |
2,315 |
3434,055 |
0,121 |
|
SD |
0,071 |
0,055 |
17,765 |
11,636 |
78,176 |
0,434 |
253,679 |
0,023 |
|
CV, % |
15 |
8 |
10 |
4 |
19 |
19 |
7 |
19 |
|
Медиана |
0,444 |
0,688 |
169,754 |
274,221 |
442,683 |
2,459 |
3502,246 |
0,126 |
Таблица 4
Содержание Рапиталама в кале крыс при однократном внутрижелудочном введении в дозе 60 мг/кг
|
№ животного |
Время, ч |
Общее кол-во (0-24 ч), мкг |
Процент от дозы, %*кг |
|||
|
0-4 |
4-8 |
8-24 |
24-48 |
|||
|
1 |
980,000 |
1368,432 |
4325,789 |
8456,351 |
15130,572 |
84,059 |
|
2 |
780,569 |
1445,876 |
4656,845 |
8234,544 |
15117,834 |
83,988 |
|
3 |
660,675 |
1345,434 |
4634,845 |
7978,542 |
14619,496 |
81,219 |
|
4 |
880,323 |
1034,564 |
4345,243 |
8654,341 |
14914,471 |
82,858 |
|
5 |
960,564 |
1546,339 |
4645,376 |
8389,450 |
15541,729 |
86,343 |
|
6 |
1530,432 |
1387,447 |
4045,987 |
8098,432 |
15062,298 |
83,679 |
|
Среднее |
965,427 |
1354,682 |
4442,348 |
8301,943 |
15064,400 |
83,691 |
|
SD |
301,249 |
172,553 |
246,739 |
247,480 |
301,828 |
1,677 |
|
CV, % |
31 |
13 |
6 |
3 |
2 |
2 |
|
Медиана |
920,444 |
1377,940 |
4490,044 |
8311,997 |
15090,066 |
83,834 |
Исследуемое вещество в неизменном виде обнаруживается в моче в низких концентрациях (2,3% от дозы). Таким образом, для Рапиталама почечный клиренс слабо выражен. С калом препарат выводится преимущественно в промежутке времени 8-24 часа. Общее количество Рапиталама в фекалиях, собранных за 24 ч, составляет около 83,7% от введенной дозы. Принимая во внимание полученные результаты, очевидно, что большая часть препарата выводится в неизменном виде.
Выводы
- Рапиталам достаточно интенсивно проникает в органы и ткани с большим уровнем гемоциркуляции. Наибольшее содержание характерно для мозга, печени, тонкого кишечника, жировой ткани, мышц и сердца. Распределения препарата в легких, коже, почках, тимусе, селезёнке и поджелудочной железе близки между собой.
- Изучение экскреции препарата показало, что в неизменном виде в моче обнаруживается низкий уровень Рапиталама, 2,3% от общей дозы. С калом препарат выводится преимущественно в промежутке времени 8-24 часа после введения в количестве 83,7% от общей дозы. Принимая во внимание данные результаты, очевидно, что большая часть препарата выводится в неизменном виде. Это является положительным фактором, поскольку биотрансформация вещества может привести к сокращению его действия.
Библиографическая ссылка
Авдеева Н.В., Покровский М.В., Куликов А.Л. ИССЛЕДОВАНИЯ ОРГАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ЭКСКРЕЦИИ СУБСТАНЦИИ РАПИТАЛАМА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26302 (дата обращения: 08.12.2024).