Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

РОЛЬ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В ОСТЕОГЕНЕЗЕ НА РАННИХ СТАДИЯХ ПРЕНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА

Асадулаева М.Н. 1 Лазько А.Е. 2
1 ФГБОУ ВО «Дагестанский государственный медицинский университет» МЗ РФ
2 ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Методами световой и электронной микроскопии, гистохимии в сравнительном аспекте исследовались локализация, содержание и спектр гликозаминогликанов в закладках бедренных костей 47 зародышей и предплодов человека женского пола при пери – и энхондральном остеогенезе в различных геохимических условиях г. Астрахани и г. Махачкалы. Установлено, что наиболее интенсивный синтез гликозаминогликанов происходит в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладок бедренной кости. Гистохимическими исследованиями выявлено, что на ранних стадиях остеогенеза в изучаемых геохимических регионах в хрящевых закладках бедренных костей гликозамингликаны представлены в основном малосульфатированными соединениями. На поздних стадиях пренатального остеогенеза наблюдается увеличение степени сульфатированности гликозаминогликанов закладок бедренных костей и быстрый рост содержания кератансульфата, что наиболее характерно для г. Махачкалы.
гликозаминогликаны
остеогенез
геохимические условия
хондроциты
гистогенез
1. Песчанский B.C. О ШИК-позитивном веществе в матриксе оссифицирующихся хрящей, эмбрионов и плодов человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1973. – Т.65, № 12. – С.46-49.
2. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная [Текст] / Э.Пирс. – М.: Иностранная литература, 1962. – 962 с.
3. Шаповалов Ю.Н. Полисахариды в тканях зародыша человека второго месяца развития // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1962. – Т.42, № 1. – С.46-53.
4. Шубич М.Г. Метод элективной окраски кислых (сульфатированных) мукополисахаридов основным коричневым // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1961. – № 2. –С.116-119.
5. Mazhuga P.M., Cherkasov V.V. Adaptive distribution of specific biosynthesis in a homoge-neous population of the articular cartilage chondrocytes // Z.mikrosk. -anat. Forsch. – 1974. – Bd. 88, № 2. – S.364–374.
6. Öbrink B. A study of the interactions between monomeric tropocollagen and glycosaminoglycans // Eur.J.Biochem. – 1973. – Vol. 33. – Р.387-400.
7. Serafini-Fracassini A., Smith F.W. Observations on the morpho¬logy of the proteinpolysaccharide complex of bovine nasal cartilage and its relationship to collagen // Proc. Roy. Soc. Ser. B. – 1966. – Vol. 165. – P.440-449.

Рядом исследователей было установлено, что участие хондроцитов в продукции белковых и полисахаридных веществ осуществляется согласно принципу преимущественного приспособления клетки к синтезу определенного вещества, или белка, или полисахарида [5]. Эта функциональная адаптация находит свое отражение в морфологии хондроцитов. В частности, хондроциты I типа содержат умеренное количество митохондрий, небольшой комплекс Гольджи и значительное количество эргастоплазмы с многочисленными цистернами, заполненными электронноплотным веществом в виде гранул и волоконец, которые идентифицируются как тропоколлаген. Хондроциты II типа характеризуются отдельными узкими каналами эргастоплазмы без расширений, небольшим количеством митохондрий и хорошо развитой системой элементов комплекса Гольджи. В их цитоплазме всегда обнаруживаются обширные области, содержащие хлопьевидные электроннопрозрачные вещества, которые отождествляются с полисахаридами.

Было также установлено, что взаимодействие между коллагеном и гликозамингликанами зависит от рH, ионного состава, ионной силы среды и по природе является электростатическим. Вследствие этого гликозамингликаны оказывают влияние как на фазы фибриллогенеза коллагена, так и на образование на фибриллах центров минерализации [6].

Однако следует отметить, что, несмотря на значительное количество фактов о биосинтезе протеогликанов и гликозамингликанов, подавляющее большинство из них получено на материале от низших млекопитающих и птиц. В доступной литературе отсутствует также комплексное исследование локализации, динамики накопления и изменения спектра протеогликанов и гликозамингликанов на стадиях пренатального морфогенеза трубчатых костей человека, к которым относятся бедренные кости, в регионах с резко различающимся набором микроэлементов в окружающей среде.

В связи с этим целью исследования явилось сравнительное изучение изменений содержания и спектра гликозамингликанов в закладках бедренных костей человека при пери- и энхадральном остеогенезе в различных геохимических условиях.

Материал и методы исследования

Материалом исследования служили бедренные кости и их закладки 47 зародышей и предплодов женского пола, полученных в результате искусственного прерывания беременности у практически здоровых женщин, и преждевременных родов, обусловленных экзогенным воздействием, из прозектур, акушерских и гинекологических клиник г. Астрахани и г. Махачкалы в осенне-зимний период.

Для электронномикроскопического исследования локализации гликозамингликанов ультратонкие срезы контрастировали на сетках 0,5 % раствором нитрата висмута [7].

Содержание гликозамингликанов в закладках бедренных костей оценивали визуально под световым микроскопом в баллах [3].

С целью выявления сульфатированных гликозамингликанов парафиновые срезы толщиной 5–7 мкм обрабатывались 0,5 % раствором коричневого основного [4].

Разделение исследуемых гликозамингликанов по степени кислотности, в значительной степени зависящей от количества сульфогрупп, достигалось применением окраски 0,5 % раствором толуидинового синего при различных кислых значениях рH мединал-ацетатного буфера, применяемого в качестве растворителя краски. При рH = 2,62 выявлялись кислые высокосульфатированные гликозамингликаны, а при рН = 6,12 – менее кислые, низко сульфатированные вещества этой группы [2].

Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования, проанализированы методами вариационной статистики и определения достоверности различий с использованием утилиты OpenOffice Calc из свободно распространяемого программного продукта OpenOffice.

Результаты исследования и их обсуждение

На всех рассматриваемых стадиях остеогенеза (6–12 недели внутриутробного развития) наиболее интенсивный синтез гликозамингликанов происходит в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладок бедренной кости; они хорошо локализуются в эндоплазматической сети и комплексе Гольджи (Рис.1). В зонах гипертрофии и дегенерации наблюдалось меньшее число хондроцитов с признаками синтеза полисахаридной части матрикса хряща, что характерно и для Астрахани, и для Махачкалы. Межклеточное пространство зон гипертрофии и дегенерации метаэпифизарного хряща содержат гликозамингликаны в виде составе электронноплотных везикул матрикса разной величины, в среднем 12,0 ± 2,3 нм, которые или связаны с волокнами коллагена, или располагаются в межклеточном пространстве свободно.

Рис. 1. Интенсивное контрастирование мембран эндоплазматической сети и комплекса Гольджи в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель из г. Махачкалы. Обработка препарата по Смиту-Серафини-Фракассини. Ув.х 10000

Гистохимическое исследование качественного состава и динамики накопления гликозамингликанов с использованием специфических топооптических реакций показало, что на ранних стадиях остеогенеза у человека (6–8 недель внутриутробного развития) в изучаемых геохимических регионах в хрящевых закладках бедренных костей гликозамингликаны представлены в основном несульфатированными соединениями. Подтверждением тому является красно-фиолетовое (В-метахроматическое) окрашивание на 2 балла толуидиновым синим с рН 6,12 гистологических препаратов хрящевых закладок и светло-желтое их окрашивание на 1 балл основным коричневым.

Относительно невелико содержание хондроитинсульфата, о чем свидетельствует слабо положительная реакция на 2 балла в территориальном матриксе эмбрионального хряща закладок при обработке срезов 0,4 М раствором хлористого магния с альциановым синим, тогда как применение красящего раствора с 0,9 М хлористым магнием приводило к бледно-голубому окрашиванию (0, 1 балл).

Таким образом, представляется весьма вероятным, что хондроитинсульфат в многоклеточном веществе хрящевых закладок бедренных костей человека 6–8 недель внутриутробного развития и в г. Астрахани, и в г. Махачкале представлен слабо сульфатированными формами и локализуются в основном в территориальном матриксе.

Количество креатинсульфата минимально и в территориальном и в межтерриториальном матриксе. В зонах роста и гипертрофии метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей на 9,10 неделях пренатального развития отмечается яркое красно-фиолетовое окрашивание межклеточного вещества хряща (3 балла) толуидиновым синим при рH буферного раствора 6,12; диффузное бледное красно-фиолетовое при рН 2,62 (2 балла) (Рис.2).

Реакция с коричневым основным приводит к развитию в этих зонах насыщенного желтого окрашивания на 2 балла матрикса хряща.

Суммарная гистохимическая реакция на хондритинсульфат и кератансульфат дает ярко-голубое окрашивание (3 балла) особенно в межтерриториальном матриксе хряща зоны гипертрофии.

Следовательно, локализация и выраженность гистохимических реакций позволяют заключить, что в зоне роста и гипертрофии костных закладок 9, 10 недель нарастает количество кислых гликозамингликанов, представленных в основном хондритинсульфатами со средней степенью сульфатированности. На данных стадиях онтогенеза количество кератансульфата увеличивается в межтерриториальном матриксе зоны гипертрофии хрящевых закладок, особенно в г. Махачкале.

Рис.2. Метахроматическое окрашивание тулуидиновым синим (pH 2,62) межклеточного вещества зоны гипертрофии метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель пренатального развития из г. Астрахани. Окраска по Пирсу. Об. 10, ок. 10

На стадиях 9,10 недель внутриутробного развития обработка срезов раствором коричневого основного по Шубичу приводит к окрашиванию в закладке кости межклеточного вещества зоны дегенерации в желто-коричневый цвет (3 балла). Окраска альциановым синим суммарна на хондроитинсульфат и кератансульфат вызывает яро-голубое окрашивание (3 балла) межклеточного матрикса как территориального, так и межтерриториального, зоны дегенерации метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей человека на стадиях 9,10 недель внутриутробного развития человека (Рис. 3).

Рис. 3. Суммарная реакция с альциановым синим на хондроитинсульфат и кератансульфат в зонах гипертрофии и дегенерации метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель пренатального развития из г. Астрахани. Окраска по Шубичу – Лопуновой. Об. 10, ок. 10

Обсуждение полученных результатов

Проведенное исследование показало, что процессы оссификации и минерализации в закладках бедренных костей человека на ранних стадиях пренатального онтогенеза (6 – 12 недель внутриут­робного развития) связаны со значительными изменениями в синте­зе, качественном составе и динамике накопления гликозаминогликанов.

Наиболее активный внутриклеточный синтез гликозаминоглика­нов наблюдается в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща. Секреторные вакуоли от комплекса Гольджи мигрируют к цитолемме, нагруженные молекулами протеогликанов, для экзоцитоза.

Если мы будем двигаться к зоне гипертрофии, то увидим, как синтез протеогликанов в хондроцитах постепенно затухает, но зато возрастает количество этих веществ, аккумулированное хрящевыми клетками на наружной поверхности своей цитолеммы и локализующе­еся в межклеточном пространстве.

Гликозаминогликаны, зафиксированные на поверхности цитолем­мы хондроцитов, возможно, предназначены для формирования полно­ценных везикул матрикса, так как нами четко определено нали­чие этих полисахаридов в составе данных образований.

Принимая во внимание высокую аффинность ионов кальция к молекулам гликозаминогликанов, заслуживает внимания предположе­ние, что эти вещества в мембране везикул матрикса играют роль первичных аккумуляторов кальция, необходимых для образования ядер кристаллизации. Не подлежит сомнению, что эту функцию гликозаминогликаны могут полноценно выполнять только в содружестве с другими факторами минерализации, в частности, с липидами и фосфолипидами.

Как показало гистохимическое исследование с применением характерных топооптических реакций на протеогликаны, в процессе развития закладок бедренных костей человека на стадиях от 6 до 12 недель пренатального раз­вития в гиалиновой зоне, зонах пролиферации, роста и гипертро­фии метаэпифизарного хряща наблюдается отчетливое уменьшение более нейтральных низкосульфатированных гликозаминогликанов с одновременным увеличением содержания веществ этой группы, прояв­ляющих кислотный характер – хондроитинсульфатов и кератансульфата.

Данный процесс более активен в закладках из зоны с повышенной минерализацией окружающей среды.

Отмечается также тенденция к увеличению степени сульфатированности гликозаминогликанов закладок бедренных костей по мере развития зародыша и предплода человека. Интересен более быстрый рост содержания кератансульфата, что также в большей степени характерно для г. Махачкалы, – наиболее сульфатированного представителя данной группы полисахаридов, который, по мнению В.О. Песчанского [1], играет значительную роль в созре­вании оссифицирующегося хряща и подготовке его к минерализации.

С началом замещения хряща костной тканью, количество гли­козаминогликанов, особенно кислых, в зонах минерализации и ре­зорбции хрящевых закладок, по данным гистохимического исследо­вания, значительно уменьшается, что, возможно, объясняется вступлением их в химические связи, необходимые для дальнейшего хода процессов остеогенеза и минерализации.

Относительно биоло­гической роли той динамики накопления и изменения качественного и количественного состава гликозаминогликанов в хрящевых закладках бедренных костей человека, которую мы выявили, мож­но сделать предположение, что гелеобразные структуры из макро­молекул протеогликанов, где преобладающим углеводным компонентом являются гиалуроновая кислота, как представитель несульфатированных гликозаминогликанов, или хондроитинсульфат и кератансульфат, относящихся к сульфатированным, значительно отличаются одна от другой по плотности и гидратированности. Наименее плотен и наиболее гидратирован гель, имеющий в своем составе преимущественно гиалуроновую кислоту, а наиболее плотен и наименее гидратирован, соответственно, гель с преобладанием кератансульфата.

Таким образом, накопление в хрящевом матриксе хондроитинсульфатов и, особенно, кератансульфата не может не отразиться на функции матрикса, так как делает его все более плотным и, следовательно, затрудняет транспорт в нем. Это приводит с течением времени к ухудшению условий существования хондроцитов, обуслов­ливает дегенерацию и разрушение их. Изменение качественного состава мат­рикса хряща закладок – замещение в нем гидрофильных гликозами­ногликанов гидрофобными высокосульфатированными приводит к вы­теснению из матрикса воды, гипергидратируя хондроциты.

Всё это приводит, в конце концов, к полной дегенерации хондроцитов и их разрыву. Освобождающиеся при этом силой гидростатичес­кого давления полость гипертрофированного хондроцита заполняется периваскулярными, эндотелиальными и клетками крови, что является жизненно важным для процесса остеогенеза.

Резюмируя вышеизложенное с точки зрения влияния повышенного содержания микроэлементов, в частности, меди и селена, в окружающей среде на оссификацию и минерализацию закладок бедренных костей, необходимо признать активизирующее влияние этого внешнего фактора на данные процессы. Максимум этого влияния приходится на период от 9 до 10 недели пренатального развития человека. На более поздних стадиях онтогенеза воздействие повышенной минерализации на остеогенез прогрессивно уменьшается.


Библиографическая ссылка

Асадулаева М.Н., Лазько А.Е. РОЛЬ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В ОСТЕОГЕНЕЗЕ НА РАННИХ СТАДИЯХ ПРЕНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 1.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26047 (дата обращения: 19.09.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074