Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Семина И.И. 1 Кабанова Т.В. 1 Порфирьева Н.Н. 1 Сафина З.З. 1 Ситенков А.Ю. 1 Елизарова А.С. 1 Мустафин Р.И. 1

---

1 ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ Минздрава России»

Проведена оценка противовоспалительной активности микрочастиц полимер-лекарственного комплекса (ПЛК) с месалазином состава EUDRAGIT® RL 30 D (RL)/месалазин (MS) на модели экспериментального колита у крыс как системы направленной доставки 5-АСК в зону воспалительной реакции. Колит у крыс вызывали введением через прямую кишку 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS). Через один час после введения TNBS и затем через каждые 12 часов в течение 5 дней крысам перорально в 1 % крахмальной слизи вводили: микрочастицы без ЛВ (15 мг/кг); MS (25 мг/кг); микрочастицы ПЛК (40 мг/кг); контрольной группе вводили 1 % крахмальную слизь. Результаты экспериментов показали, что лечение крыс ПЛК с месалазином уменьшает активность маркеров воспалительной реакции – миелопероксидазы (МРО) и малонового диальдегида (МДА) в гомогенате толстого кишечника крыс и уменьшает симптомы воспалительной реакции (наличие крови в фекалиях), в отличие от субстанции MS. Проведенные исследования свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки ПЛК в качестве инновационной лекарственной формы для направленной доставки месалазина.

Статья в формате PDF

191 KB

полимер-лекарственный комплекс

месалазин

модель экспериментального колита

миелопероксидаза

малоновый диальдегид

1. Мустафин Р.И., Кабанова Т.В., Сёмина И.И., Буховец А.В., Гарипова В.Р. Биофармацевтическая оценка поликомплексной матричной системы доставки в толстый отдел кишечника на основе Carbomer 940/Eudragit® ЕРО/ // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – Т. 45, № 8. – С.41–44.

2. Мустафин Р.И., Гарипова В.Р., Семина И.И. [и др.]. Сравнительное исследование поликомплексов на основе Carbopol и противоположно-заряженных полиэлектролитов как новых систем пероральной доставки // Химико-фармацевтический журнал. – 2015. – Т. 49, № 1. – С.3–8.

3. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии // Медицина. – Москва, 1977. – С. 66–68.

4. Bondesen S. Intestinal fate of 5-aminosalicylic acid: regional and systemic kinetic studies in relation to inflammatory bowel disease. Pharmacol Toxicol. 1997; 81 Suppl 2:1–28.

5. Bradley P.P. et al. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker. J Invest Dermatol. 1982; 78(3):206–9.

6. Fallingborg J. Intraluminal pH of the human gastrointestinal tract. Dan Med Bull. 1999 Jun; 46(3):183-96.

7. Fedorak R.N. et al. Colonic delivery of dexamethasone from a prodrug accelerates healing of colitis in rats without adrenal suppression. Gastroenterology. 1995; 108(6):1688–99.

8. Friedman G. Sulfasalazine and new analogues. Am J. Gastroenterol. 1986;81(2):141–4.

9. Klotz U. Clinical pharmacokinetics of sulphasalazine, its metabolites and other prodrugs of 5-aminosalicylic acid. Clin. Pharmacokinet. 1985; 10(4):285–302.

10. Krawisz J.E., Sharon P., Stenson W.F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 984; 87(6):1344–50.

11. Kruis W., Kiudelis G., et al. Once daily versus three times daily mesalazine granules in active ulcerative colitis: a double-blind, double-dummy, randomized, noninferiority trial. Gut 2009; 58(2):233–40.

12. Layer P.H. et al. Delivery and fate of oral mesalamine microgranules within the human small intestine. Gastroenterology. 1995 May; 108(5):1427-33.

13. Sandborn W.J. et al. MMX Multi Matrix System® mesalazine for the induction of remission in patients with mild-to-moderate ulcerative colitis: a combined analysis of two randomized, double-blind, placebo-controlled trials Aliment Pharmacol Ther 26, 205–215, 2007.

14. Sujata P. Sawarkar, S.G. Deshpande, A.N. Bajaj, and V.S. Nikam. In Vivo Evaluation of 5-ASA Colon-Specific Tablets Using Experimental-Induced Colitis Rat Animal Model. AAPS PharmSciTech, 2015. Vol. 16. No. 6.

Месалазин, или 5-аминосалициловая кислота (5-АСК), является препаратом первой линии – золотым стандартом терапии воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), таких как язвенный колит и болезнь Крона, которые в настоящее время были и остаются одной из наиболее серьезных проблем современной гастроэнтерологии.

Известно, что при приеме внутрь чистый месалазин быстро и практически полностью метаболизируется в тонком  кишечнике до неактивного метаболита, который  всасывается в кровь и выводится почками, то есть действующее вещество не доходит  до  места, где локализуется воспалительный процесс [4]. В настоящее время разработаны и продолжают разрабатываться различные способы  доставки 5-АСК до места воспаления – так,  в практической медицине применяются лекарственные формы месалазина с молекулой-переносчиком  сульфапиридином  –  препарат сульфасалазин  [8,9]. Недостатки этой лекарственной формы заключаются в том, что помимо серьезных побочных эффектов, которые могут возникнуть на любом этапе лечения сульфасалазином, ряд исследований показал более низкую эффективность терапии ВЗК по сравнению с препаратами «чистого» месалазина. Таблетки с замедленным высвобождением месалазина  защищают месалазин с помощью оболочки из этилцеллюлозы, которая  обеспечивает равномерную концентрацию 5-АСК как в тонкой, так и в толстой кишке, но если воспаление локализовано только в толстой кишке, 30–50 % действующего вещества инактивируется, не проявляя при этом лечебного действия  [12]. Лекарственные формы  с рН-зависимым высвобождением 5-АСК обеспечивают высвобождение 100 % месалазина при достижении определенных значений рН. Однако в ряде случаев при закислении внутрикишечной среды (при воспалительных процессах) может не происходить растворение оболочки  [6].  Разработки оптимальной лекарственной формы месалазина ведутся и в других направлениях [13].   В последние годы  разработаны новые лекарственные формы, которые сочетают преимущества двух систем: и рН- зависимое и  равномерное высвобождение «по времени»  –  препараты  месалазин ММХ и Салофальк^® гранулы [11,14]. Несмотря на интенсивность в области разработки лекарственных форм месалазина, они не лишены недостатков [6], кроме того, многообразие видов ВЗК требует терапии препаратами месалазина с различными фармакокинетическими параметрами. Важным является и то, что на российском фармацевтическом рынке существует только один препарат месалазина – сульфасалазин, который значительно уступает по эффективности  ММХ и Салофальк^® и обладает достаточно большим числом побочных эффектов, обусловленных самим переносчиком – сульфапиридазином. 

Ранее нами были разработаны и описаны пероральные системы  направленной доставки в ЖКТ диклофенака натрия, индометацина, теофиллина [1,2]  и выявлены закономерности  конструирования таких систем.  На основе  этих закономерностей, а также  с учетом достоинств и недостатков имеющихся лекарственных препаратов месалазина с доставкой  в области воспалительного процесса нами был разработан новый подход к созданию лекарственной формы месалазина – на основе интерполимерных взаимодействий между лекарственным веществом  и носителем – и  получен полимер-лекарственный комплекс (ПЛК) с месалазином.

Целью настоящего исследования явилась оценка противовоспалительной активности   микрочастиц   ПЛК  с месалазином на модели экспериментального колита у крыс как системы направленной доставки 5-АСК  в  зону воспалительной реакции.

Материалы и методы исследования

Исследуемый объект представляют собой полимер-лекарственный комплекс (ПЛК) в виде микрочастиц состава EUDRAGIT^® RL 30 D/месалазин  в соотношении 1:2 (RL:MS, моль/моль). ПЛК был получен с использованием полимера  марки  Eudragit^® RL30D (RL) с ММ 150 КДа (Evonik Röhm GmbH, Германия) и модельного лекарственного вещества месалазина (MS) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия). Эксперименты с исследованием кинетики высвобождения MS из сред, имитирующих физиологические среды желудочно-кишечного тракта, показали, что высвобождение MS начинается с рН= 5,8 и продолжается до значений рН =7,0.

С целью доказательства безопасности применения микрочастиц EUDRAGIT^® RL 30 D, используемых для доставки MS лабораторным крысам, нами была проведена оценка его «острой токсичности» и  характера общего действия.  Микрочастицы EUDRAGIT^® RL 30 D вводили в дозах 1000, 2000 и 3000 мг/кг в желудок в крахмальной слизи с использованием специального зонда. Каждая доза вводилась 6 крысам. Проводили анализ картины общего действия (наличие угнетающего или возбуждающего действия со стороны центральной нервной системы, отличительные особенности в поведении в сравнении с животными контрольной группы). Кроме того, картину общего действия комплексов на крыс при введении в течение 7 дней определяли по адекватности ориентировочно-исследовательской реакции и двигательной активности. Для изучения ориентировочно-исследовательской реакции и двигательной активности использовали «открытое поле», которое представляет камеру круглой формы с диаметром 50 см с отверстиями. В «открытом поле» в течение 3 мин регистрировали: а) количество пересечений линий и вертикальных стоек, что отражает неспецифический уровень возбуждения; б) количество заглядываний в отверстия как показатель исследовательской активности животного.

Противовоспалительную активность микрочастиц ПЛК с MS в сравнении с субстанцией MS и микрочастицами без MS исследовали на модели воспаления кишечника у крыс. До начала экспериментов все животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете в соответствии с действующими нормами при свободном доступе к воде и пище (Приказ МЗ и СР РФ № 708н), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»). Все исследования были согласованы с комитетом по этической экспертизе.

 Нами была использована стандартная экспериментальная модель колита, индуцированного у крыс путем введения через прямую кишку 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия). В экспериментах было использовано 30 крыс, весом  200–220 г,   которые были разделены на 5 групп (n=6 в каждой группе).   Крысам    четырех групп вводили через прямую  кишку TNBS в дозе 20 мг на 1 крысу в 5 % растворе  этанола. Животных  произвольно распределяли в разные экспериментальные группы и рассаживали в индивидуальные клетки.   Предварительно  крысам производили мягкую анестезию внутрибрюшинным введением 25 мг/кг кетамина   (Московский эндокринный завод, Россия). Через один час после введения TNBS и затем через каждые 12 часов в течение 5 дней крысам  перорально в 1 % крахмальной слизи вводили:  микрочастицы  без ЛВ (ПК без MS, 15 мг/кг); MS (25 мг/кг)  ПЛК (40 мг/кг);  контрольной группе вводили 1 % крахмальную слизь; животным пятой группы (интактные) вводили крахмальную слизь без предварительного введения TNBS. В последний день исследования у крыс  определяли  наличие диареи и скрытой крови в фекалиях и измеряли массу тела. Маркером воспалительной реакции в гомогенате толстого кишечника явились   активность миелопероксидазы (МРО), в качестве вспомогательного маркера использовали конечный продукт перекисного оксисления липидов – малоновый диальдегид (МДА),  концентрация которого существенно возрастает при воспалительной реакции, а MS обладает выраженной антиоксидантной активностью.   Подготовку материала для МРО осуществляли  согласно [10] с использованием пероксида водорода и o-дианизидина, являющегося субстратом пероксидаз. Измерения проводили на УФ/Вид-спектрофотометре Lambda 25 (Perkin Elmer, США). Определение содержания  малонового диальдегида (МДА) проводили  согласно методу [3].

Результаты экспериментов были обработаны с использованием t-критерия Стъюдента.

Результаты исследования

Результаты исследования токсичности микрочастиц, используемых для доставки MS, свидетельствуют об их безопасности при применении экспериментальным животным. Крысы оставались живы, и их поведение не отличалось от такового у контрольной группы. 3000 мг/кг – максимальная доза, которую возможно было ввести экспериментальным животным, поэтому ЛД-50 (основной показатель, характеризующий «острую» токсичность, определить не удалось).

 Оценка поведения крыс в открытом поле при пероральном введении микрочастиц в максимальной дозе 3000 мг/кг в течение 7 дней показала, что животные опытной и контрольной групп практически не отличались по показателям двигательной и исследовательской активности (табл. 1), что может предполагать об их  безопасности при применении в составе ПЛК с месалазином.

Таблица 1

Двигательно-исследовательская активность крыс при пероральном введении микрочастиц EUDRAGIT^® RL 30 крысам в течение 7 дней

Результаты исследования противовоспалительной активности показали, что  введение TNBS крысам в 100 % случаев вызывало появление крови в фекалиях, существенное снижение (до 15 % от исходной) массы тела  (табл. 2).   У животных, которые в течение 5 дней получали перорально ПЛК, снижение массы тела было значительно меньше (до 5 %) по сравнению  со всеми опытными группами, в том числе с группой крыс, которым вводили субстанцию MS. Кроме того, при введении ПЛК наличие в фекалиях крови было отмечено только у 1 крысы.

Таблица 2

Динамика массы тела крыс и некоторые стороны клинической картины при развитии воспаления толстого кишечника, вызванного TNBS

Примечание: ^* – разница достоверна при р < 0,05.

Анализ результатов при определении активности маркеров воспалительной реакции МРО и МДА (табл. 3) по сравнению с другими группами крыс (на 54 % при р<0,05), что свидетельствует о выраженном противовоспалительном эффекте при введении этого комплекса. Внеклеточная МРО является показателем активации нейтрофилов при различных воспалительных процессах, включая воспалительные заболевания кишечника, и  определение ее содержания  используется для оценки уровня воспаления в толстом кишечнике и эффективности лекарственных препаратов [10,7]. Значения уровня МРО при введении субстанции MS, что было очевидно, практически не отличались от таковых значений контрольных крыс. Аналогичная картина наблюдалась и при сравнении концентрации МДА во всех экспериментальных группах животных: наименьшие значения этого показателя были отмечены при введении крысам образца ПЛК с месалазином, что подтверждает противовоспалительную эффективность этой композиции. 

Таблица 3

Концентрация миелопероксидазы и малонового диальдегида в гомогенате толстого кишечника крыс при воспалении, вызванном введением TNBS

* – разница достоверна при р < 0,05 по отношению к контролю (интактные).

** – разница достоверна при р < 0,05 по отношению к контролю (TNBS).

Известно, что эффективность месалазина проявляется только при его высокой местной концентрации в кишечнике, но при приеме внутрь чистый месалазин быстро и практически полностью метаболизируется до неактивного метаболита – N-ацетил-5-АСК, который всасывается в кровь и выводится почками, не достигая места локализации воспалительного процесса в кишечнике. Этим и объясняется неэффективность MS на модели колита у крыс. Создание  защиты MS от инактивации в верхних отделах кишечника с использованием  комплекса RL/MS обеспечивает доставку 5-АСК в область локализации воспаления и тем самым обеспечивает его противовоспалительную активность. Полученные нами данные коррелируют с результатами, полученными ранее in vitro, показавшими способность комплекса пролонгировано высвобождать  MS в течение 8 часов, начиная с рН=5,8 до рН=7,0. Полученные результаты могут иметь высокую прогностическую значимость для последующей разработки на основе комплекса RL/MS инновационной лекарственной формы месалазина, которая может обеспечивать доставку как в дистальные отделы тонкого кишечника, так и в область толстого кишечника. Кроме того, разработанная система может быть эффективной и при закислении внутрикишечной среды.

Выводы:

1. Полимер-лекарственный комплекс с месалазином (ПЛК) в виде микрочастиц состава EUDRAGIT^® RL 30 D/месалазин в соотношении 1:2 при 5-дневном применении  крысам уменьшает симптомы колита, вызванного введением через прямую кишку 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS):  предотвращает существенное снижение массы тела  и появление крови в фекалиях крыс.
2. ПЛК состава EUDRAGIT^® RL 30 D/месалазин, вводимый в течение 5 дней крысам с моделью колита, вызванного ректальным введением TNBS, снижает в гомогенате толстой кишки уровень маркеров воспаления –  миелопероксидазы (МРО)  и малонового лдиальдегида (МДА).
3. Результаты исследования безопасности и противовоспалительной активности ПЛК   RL/MS свидетельствуют о перспективности его дальнейшей разработки и создания на его основе инновационной лекарственной формы для направленной доставки месалазина (5-АСК) в зоны воспалительного процесса при колитах и болезни Крона.

Исследования поддержаны грантом Российского Научного Фонда № 14-15-01059.

Библиографическая ссылка