Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Александров А.В. 1 Шилова Л.Н. 2 Александрова Н.В. 1 Ненашева Н.В. 1 Александров В.А. 1 Емельянов Н.И. 2

---

1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии»

2 ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ

Для своевременной диагностики ревматических заболеваний целесообразно расширение круга используемых в клинической практике иммунологических показателей. Наиболее перспективным является определение различных аутоантител, в том числе к ферментам пуринового метаболизма (ПМ), с помощью иммуноферментного метода (ИФА). Это может быть достигнуто при создании необходимых условий для перевода растворимых биополимеров (энзимов) в нерастворимую форму с сохранением их биологических свойств и возможностью дальнейшего использования в качестве антигенной матрицы в иммунологических методах диагностики. В ходе исследования удалось получить иммобилизированные формы основных ферментов ПМ (аденозиндезаминаза, 5-нуклеотидаза, пуриннуклеозидфосфорилаза, гуаниндезаминаза, ксантиноксидаза, аденозинкиназа), причем процедура иммобилизации не вызывала изменения их биологических свойств. При определении антител к ферментам ПМ в сыворотке крови больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой применение иммобилизированных ферментов (в качестве антигенной матрицы) в разработанном нами варианте ИФА позволило повысить чувствительность этого метода в 3–4 раза, по сравнению с традиционным вариантом ELISA-теста.

Статья в формате PDF

177 KB

антитела

ферменты

пуриновый метаболизм

ревматоидный артрит

системная красная волчанка

1. Бегун Д.Н. Многомерная модель факторов риска развития ревматических болезней. Социальные аспекты здоровья населения [электронный научный журнал] 2014; 35(1). URL: http://vestnik.mednet.ru/content/view/539/30/lang,ru.

2. Галушко Е.А. Медико-социальная значимость ревматических заболеваний: автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Москва, 2011. – 46 c.

3. Гонтарь И.П., Сычева Г.Ф., Александров А.В., Шилова Л.Н., Симакова Е.С., Емельянов Н.Н., Матасова Н.Н., Маслакова Л.А., Зборовский А.Б. Эмульсионная полимеризация как метод, модифицирующий ферменты с сохранением биологических свойств их наноструктур // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 12. – С. 715-719.

4. Гонтарь И.П., Зборовский А.Б., Левкин С.В., Сычева Г.Ф. Способ получения магнитных полиакриламидных гранул // Авторское свидетельство № 1582657. – 1990.

5. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. – М., 2006. – С. 3.

6. Сущук Е.А. Клинико-диагностическое значение определения антител к церулоплазмину у больных системной красной волчанкой с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами: дис. … канд. мед. наук. – Волгоград, 2002. – 237 с.

7. American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism classification criteria for rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. – Vol. 62, N 9. – Р. 2569–2580.

8. Hochberg M.C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum. 1997; 40(9): 1725-9.

9. Wiik A.S., Gordon T.P., Kavanaugh A.F., Lahita R.G., Reeves W., van Venrooij W.J., Wilson M.R., Fritzler M., and the IUIS/WHO/AF/CDC Committee for the Standardization of Autoantibodies in Rheumatic and Related diseases. Cutting edge diagnostics in rheumatology: the role of patients, clinicians, and laboratory scientists in optimizing the use of autoimmune serology // Arthritis Rheum. (Arthritis Care & Research) 2004; 51: 291-8.

Ревматические заболевания (РЗ) занимают важное место в структуре заболеваемости населения и имеют огромное социально-экономическое значение, находясь в ряду основных причин временной и стойкой нетрудоспособности, а также существенного ухудшения качества жизни [1, 2]. Для своевременной диагностики РЗ целесообразно расширение круга используемых клинико-лабораторных, и в первую очередь иммунологических показателей [5, 9]. Для определения аутоантител (Ат) в сыворотке крови больных РЗ используются самые различные подходы, но в настоящее время наиболее широко применяются иммуноферментный (ИФА) и иммунофлюоресцентный методы анализа [9].

Иммунная система обладает определенной автономностью в распознавании и удалении чужеродных клеток, антигенов и других веществ, но, наряду с этим, она находится под строгим гомеостатическим контролем, участие в котором принимает и множество биохимических реакций. Существующая биохимическая гетерогенность большинства РЗ, очевидно, обусловлена наличием конституциональной биохимической индивидуальности человека и зависит от нарушений именно надмолекулярного порядка, затрагивающих клеточные, тканевые, системные уровни.

Расширение спектра изучаемых при РЗ аутоантител (в том числе и к энзимам различных метаболических путей) может быть достигнуто переводом растворимых биополимеров в нерастворимую форму с сохранением их биологических свойств и возможностью дальнейшего использования в качестве антигенной матрицы в иммунологических методах диагностики.

Возросший интерес к изучению метаболизма пуриновых соединений в норме и при патологии связан не только со значением пуринового метаболизма (ПМ) в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части: ферменты и промежуточные субстраты. Учитывая характерные иммунологические нарушения при РЗ, можно предположить, что изменение энзиматической активности ряда ферментов пуринового метаболизма может быть связано с гиперпродукцией аутоантител к ним.

Цель исследования: получить иммобилизированные формы основных ферментов ПМ, изучить их физико-химические свойства, отработать условия и технику постановки иммуноферментного анализа с использованием антигенных наносистем (АНС) на основе энзимов ПМ для определения специфических аутоантител в сыворотке крови больных РЗ.

Материалы и методы

В качестве антигенов использовались коммерческие препараты основных ферментов пуринового метаболизма производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США): препарат аденозиндезаминазы (АДА, Adenosine deaminase from human erythrocytes, Cat. № BCR-647, с активностью 2,55 μkat/l; сертифицированный эталонный материал); препарат 5'-нуклеотидазы (5-НТ, 5′-Nucleotidase human, Cat. № N 1665, recombinant, expressed in CHO cells); препарат пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ, Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N 3514); препарат гуаниндезаминазы (ГДА, Guanase from rabbit liver; Cat. № G 5752); препарат ксантиноксидазы (КО, Cat. № Х 2252), а также препарат аденозинкиназы (АДК, Human Adenosine Kinase Protein, Novus Biologicals, Cat. № NBP1-44382 и Human Adenosine Kinase Recombinant Protein, Abnova Corporation (HQ), Taiwan R.O.C., Cat. № H00000132 -P01).

Для получения иммобилизированных форм изучаемых ферментов использовали растворы с соответствующей концентрацией: для АДА – 100 мкг/мл, для 5'-НТ – 100 мкг/мл; для ПНФ – 50 мкг/мл; для ГДА – 20 мкг/мл; для КО – 50 мкг/мл и для АДК – 50 мкг/мл.

Результаты ELISA-тестов учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности (Ед). Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 3 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.

В группу исследования были включены 178 больных ревматоидным артритом (РА) и 60 больных системной красной волчанкой (СКВ).

Диагностика РА осуществлялась в ходе всестороннего клинического обследования при поступлении больных на стационарное лечение с использованием диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации (АРА) и уточнялась в процессе лечения. Под наблюдением находились 178 больных РА, из которых 126 (70,8 %) женщин и 52 (29,2 %) мужчин. Средний возраст больных – 48,9 ± 13,2 года. Средняя продолжительность РА составила 11,14 ± 2,33 года. I (минимальная) степень активности РА выявлена у 34 (19,1 %), II (умеренная) – у 128 (71,9 %) и III (максимальная) – у 16 (9 %) больных. Следует отметить, что поражения сердца, почек, ревматоидные узелки, лимфаденопатия и церебральный васкулит чаще отмечались у больных с высокой активностью ревматоидного процесса. Выявлялась определенная зависимость частоты системных поражений от степени активности патологического процесса: чем выше активность РА, тем больше частота внесуставных поражений (при активности I – 29,4 %, при активности II – 34,4 %, при III степени активности заболевания – 87,5 %).

Диагноз СКВ ставился на основании тщательного клинико-лабоpатоpного обследования больных и верифицировался по модифицированным критериям американского общества ревматологов 1982 года, пересмотренным в 1997 году. Средний возраст больных СКВ составил 36,32±15,27 лет. Среди больных СКВ преобладали женщины (91,7 %), абсолютное большинство составляли лица трудоспособного возраста (90 %), вместе с тем 41 пациент (68,3 %) имел ту или иную степень стойкой утраты трудоспособности. Активность СКВ оценивалась с помощью индексов SLEDAI (8,93 ± 5,74) и ECLAM (5,30 ± 2,79), а также по критериям, предложенных В.А. Насоновой. Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измерялось с помощью индекса SLICC/ACR DI (1,95 ± 1,71).

Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программных пакетов «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA).

Результаты исследования

Учитывая достаточную относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферментов (АДА – 36 кДа, 5'-НТ – 60-120 кДа; ПНФ – 90-92 кДа; ГДА – 100-120 кДа; КО – 240 кДа; АДК – 40 кДа), иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации И.П. Гонтаря с соавт. [4] в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала. По завершении полимеризации гранулы магнитосорбентов в течение 15–20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом твин-20 (0,05 %) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана.

В итоге были получены АНС, представляющие собой двойные полиакриламидные гранулы правильной сферической формы с размером частиц от 10 до 100 мкм. Средний диаметр гранул составил 58±7,2 мкм (при соотношении полимерный носитель : железо 2 : 1, в пересчете на сухую массу). Гранулы имели длительный срок хранения (до 24-х месяцев); после регенерации они были пригодны для повторного использования в методах иммуноанализа [3].

Процедура иммобилизации АДА, ГДА, 5'-НТ, ПНФ не вызывала изменения биологических свойств ферментов (табл. 1).

Таблица 1

Влияние иммобилизации на биологические свойства ферментов

Активность иммобилизированной формы большинства ферментов (АДА, 5-НТ, ПНФ, ГДА и АДК) сохранялась более года (КО до 9–10 месяцев), в то время как для растворимой формы энзимов было отмечено существенное снижение активности уже через 2–3 месяца.

Наряду с этим, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов снизилась практически до нуля, а иммобилизированных – незначительно (для АДА и 5-НТ уменьшилась на 5 %, для ПНФ – на 12 %, для ГДА и АДК – на 10 %, для КО – на 14 %).

На этапе выбора предпочтительного варианта иммуноферментного метода определения Ат к ферментам был проведен сравнительный анализ методики ИФА, основанной на использовании микротитрационных полистироловых планшетов (классический вариант ELISA-теста), и разработанного нами варианта ИФА с использованием АНС. Предполагаемые различия в результатах (при использовании классического варианта ИФА и иммуноферментной методики с применением АНС) могли быть объяснены с точки зрения свойств адсорбции белка на полистироле (анализ на микротитрационных полистироловых планшетах) и включения белка в структуру геля (анализ с помощью АНС) и кинетики реакции образования комплекса антиген-антитело на разделе фаз.

Сорбционная емкость гранулы АНС, рассчитанная с использованием модели Esser P. (1997 г.), более чем в 10 раз превышает площадь поверхности лунки (для планшета Nunc MaxiSorp) при традиционном варианте ИФА. В одной пробе доступность для реакции антигена почти в 3 раза больше при использовании гранул АНС, чем при постановке анализа с антигеном, сорбированном на планшете [6].

При постановке иммуноферментного анализа с использованием АНС наблюдаются как повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, так и существенное увеличение концентрации антигена (в нашем случае ферментов ПМ) при уменьшении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул АНС в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, существенно повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе, и реакция антиген – антитело смещается в направлении образования комплекса.

Таким образом, учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием АНС имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [5], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам ПМ, предпочтение было отдано ИФА с использованием АНС.

В группу исследования были включены 178 больных с достоверным диагнозом ревматоидного артрита [7] и 60 больных с достоверным диагнозом системной красной волчанки [8].

Количество больных РА с повышенным уровнем Ат к АДА (при проведении ИФА с использованием АНС) составило 98 человек, к 5'-НТ – 96 человек, к ПНФ – 106 человек, к ГДА – 80 человек, к КО – 106 человек, к АДК – 36 человек. Различия в эффективности выявления антител к ферментам ПМ у больных РА при использовании двух вариантов ИФА представлены в таблице 2.

Таблица 2

Количество больных РА с повышенным уровнем антител к ферментам ПМ при использовании стандартного ELISA-теста и ИФА на основе АНС, в %

Количество больных СКВ с повышенным уровнем Ат к АДА (при проведении ИФА с использованием АНС) составило 32 человека, к 5'-НТ – 32 человека, к ПНФ – 25 человек, к ГДА – 29 человек, к КО – 30 человек, к АДК – 28 человек. Различия в эффективности выявления антител к ферментам ПМ у больных СКВ при использовании двух вариантов ИФА представлены в таблице 3.

Таблица 3

Количество больных СКВ с повышенном уровнем антител к ферментам ПМ при использовании стандартного ELISA-теста и ИФА на основе АНС, в %

Применение иммобилизированных ферментов в разработанном нами варианте ИФА с использованием АНС позволило повысить чувствительность этого метода в 3–4 раза, по сравнению с традиционным вариантом ИФА, в первую очередь, за счет увеличения концентрации антигенов в 20–100 раз, площади соприкосновения фиксированных антигенов с антителами, частоты встречаемости иммобилизированных антигенов с магнитными свойствами с соответствующими иммуноглобулинами при применении магнитной мешалки.

Вырабатываемые антитела способны модифицировать фермент, ингибируя или усиливая его энзиматическую активность. Кроме того, сами антитела и иммунные комплексы могут проявлять свойства ферментов, что в определенной степени может объясняться их возможными конформационными изменениями при взаимодействии с антигеном. Одной из возможных причин изменения активности ферментов ПМ в сыворотке крови больных РЗ может являться изменение иммунного статуса с усилением антителообразования к данным энзимам.

Заключение

Изучение процессов образования и функционирования Ат к основным ферментам ПМ у больных РЗ с помощью АНС в иммуноферментном методе, а также исследование «срыва» толерантности к наиболее защищенным от воздействия иммунной системы белковых структур – энзимам, способно помочь в определении влияния Ат к ферментам ПМ на функционирование соответствующих энзимов и обозначить роль данных Ат в активации патологического процесса и развитии повреждения при РЗ.

Библиографическая ссылка