Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лычева Н.А. 1, 2 Шахматов И.И. 1, 2 Блажко А.А. 1 Седов А.В. 1

---

1 ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России

2 ФГБНУ «НИИ физиологии и фундаментальной медицины» СО РАН

Цель: изучить состояние системы гемостаза и микроциркуляторного русла в гипотермический и постгипотермический периоды у крыс. Материалы и методы: в исследовании использовались крысы-самцы линии Вистар (30 особей). Животные экспериментальных групп подвергались однократному иммерсионному охлаждению в воде температурой 5 °С до достижения умеренной степени гипотермии, контрольная группа животных помещалась в воду температурой 30 °С. У животных 1-ой группы анализ состояния микроциркуляторного русла и забор крови осуществлялся сразу по достижении умеренной степени гипотермии. Во 2-ой группе – через 48 часов после прекращения охлаждения. Результаты и их обсуждение. Сразу по достижении умеренной степени гипотермии регистрировалась гипоагрегация и гиперкоагуляция на фоне увеличения перфузии тканей кровью. По истечении 2-х суток с момента прекращения охлаждения регистрировалась гиперагрегация и гиперкоагуляция, со стороны микроциркуляторного русла регистрировался вазоспазм.

Статья в формате PDF

212 KB

гипотермия

гемостаз

микроциркуляция

1. Функционально-морфологические изменения сердца при гипотермии / Ф.В. Алябьев, А.М. Парфирьева, Н.П. Чесалов и др. // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т. 23. – № 1-1. – С. 68-70.

2. Эфферентная терапия в комплексном лечении холодовой травмы, осложненной синдромом полиорганной недостаточности / А.Ф. Потапов, Р.З. Алексеев, С.Ю. Евграфов // Якутский медицинский журнал. – 2012. – № 2. – С. 114-118.

3. Alva, N. Oxidative stress and antioxidant activity in hypothermia and rewarming: can RONS modulate the beneficial effects of therapeutic hypothermia / N. Alva, J. Palomeque, T. Carbonell // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. – 2013. – Vol. 13. – Р. 54-64.

4. Arrhythmogenesis in severe vs. Therapeutic hypothermia / J. S. Piktel, D. Jeyaraj, T. H. Said et al. // Circ. Arrhythm. Electrophysiol. – 2011. – Vol. 4(1). – P. 79–86.

5. Clinical hypothermia temperatures increase complement activation and cell destruction via the classical pathway / T.A. Shah, C.T. Mauriello, P.S. Hair et al. // Journal of Translational Medicine. – 2014. – Vol. 12. – P. 181-187.

6. Corry, J.J. Use of hypothermia in the intensive care unit / J.J. Corry, W. J. Crit. // Care Med. – 2012. – Vol. 1(4). – P. 106-122.

7. Critical role for telomerase in the mechanism of flow-mediated dilation in the human microcirculation / A. M. Beyer, J. K. Freed, M. J. Durand et al // Circulation Research. – 2016. – P. 856-866.

8. Early microcirculatory impairment during therapeutic hypothermia is associated with poor outcome in post-cardiac arrest children: A prospective observational cohort study / E.A.B. Buijsa, E.M. Verbooma, A.P.C. Topb et al // Resuscitatio. – 2014. – Vol. 85. – P. 397–404.

9. Effects of different types of fluid resuscitation for hemorrhagic shock on splanchnic organ microcirculation and renal reactive oxygen species formation / C.Y. Wu, K. Chan, Y.-J. Cheng et al. // Critical Care. – 2015. – Vol. 19 (434).

10. Effect of temperature on thromboelastography (TEG) and implications for clinical use in neonates undergoing therapeutic hypothermia / K.R. Forman, E. Wong, M. Gallagher et al. // Pediatr. Res. – 2014. – Vol. 75(5). – P. 663–669.

11. Horosz, B. Inadvertent intraoperative hypothermia / B. Horosz, M. Malec-Milewska // Anaesthesiology Intensive Therapy. – 2013. – Vol. 45 (1). – P. 38–43.

12. Microcirculatory perfusion and vascular reactivity are altered in post cardiac arrest patients, irrespective of target temperature management to 33 ◦C vs 36 ◦C / M. Koopmansa, M.A. Kuipera, H. Endemanb, et al // Resuscitation. – 2015. – Vol. 86. – P. 14–18.

13. Seventy-two hours of mild hypothermia after cardiac arrest is associated with a lowered inflammatory response during rewarming in a prospective observational study / L.A. Bisschops, J. G.van der Hoeven, T. E. Mollnes et al. // Critical Care. – 2014. 1-8.

Гипотермия оказывает генерализованное воздействие на организм, выступая не только в качестве естественного фактора внешней среды, но и искусственно создаваемой среды, используемой в практической медицине. В практической медицине гипотермия является обязательным условием при проведении операций на открытом сердце [1, 5], а также важным компонентом комплексной терапии ряда неотложных состояний [6, 9, 10]. В формировании острой ответной реакции на холод вовлекаются все органы и системы. При этом основными компонентами, обеспечивающими адекватность трофики тканей, являются микроциркуляторное русло и система гемостаза. Показано, что действие гипотермии способствует развитию полиорганной недостаточности [7, 9, 12]. Немаловажным является изучение состояния микроциркуляторного русла и системы гемостаза в постгипотермический период, характеризующийся формированием и манифестацией травматических последствий действия общего переохлаждения на организм [12, 13]. Прогнозирование возможных нарушений со стороны микроциркуляторного русла и системы гемостаза, развивающихся после прекращения охлаждения, позволит минимизировать последствия повреждающего действия гипотермии на организм. Цель исследования: изучить состояние системы гемостаза и микроциркуляторного русла в различные периоды действия умеренной гипотермии у крыс.

Материал и методы исследования

Исследования выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar, массой 300 ± 15 г. Общая управляемая иммерсионная гипотермия моделировалась путем помещения животных в воду температурой 5 °С и воздуха 7 °С на фоне предварительной наркотизации, на станке фиксаторе. Критерием прекращения воздействия служило достижение экспериментальными животными ректальной температуры 27…30 °С, что соответствовало умеренной степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и составило 5 ± 3 минуты. Контролем служила кровь 10 животных, полученная после того, как они на фоне предварительной наркотизации в индивидуальных клетках помещались в воду температурой 30 °С и воздуха 22…25 °С. Время экспозиции соответствовало времени охлаждения животных опытной группы. В дальнейшем все животные были поделены нами на группы. У животных 1-ой группы анализ состояния микроциркуляторного русла и забор крови осуществлялся сразу по достижении умеренной степени гипотермии. Во 2-ой группе – через 48 часов после прекращения охлаждения.

У всех животных исследовались показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтная и фибринолитическая активность плазмы крови с помощью наборов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили по G.V.R. Born (1962) на агрегометре «Биола» (Россия), в качестве индуктора использовался раствор аденозиндифосфата АДФ концентрацией 10 мкг/мл. Тромбоэластометрия выполнялась на приборе «Rotem» (“Pentapharm GmbH”, Германия) с использованием реагента «Natem», в состав которого входит хлорид кальция. Кровь для исследования в объеме 5 мл получали путем забора из печеночного синуса в полистироловый шприц, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствора цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Для изучения состояния микроциркуляторного русла использовалась лазерная доплеровская флоуметрия (ЛДФ). Методика ЛДФ проводилась на аппарате ЛАКК-02 (НПО Лазма, Россия), при этом регистрировали основные параметры микроциркуляции, а также проводили анализ амплитудно-частотного спектра колебаний кровотока. Головка оптического зонда фиксировалась в основании хвоста экспериментального животного. Длительность записи ЛДФ-граммы составила 7 минут.

До проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания согласно требованиям GLP. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте и Директивами – 86/609/EEC. Обезболивание и умерщвление животных проводилось в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Сравнение полученных результатов осуществляли путем вычисления медианы (Ме) и процентилей (25 % и 75 %). Статистический анализ выполнен с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни, на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования показателей системы гемостаза у животных контрольной и всех экспериментальных групп представлены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели системы гемостаза у крыс в различные периоды постгипотермии

Примечание: данные представлены в виде Ме – медиана выборки, [25÷75] – процентили выборки; * – статистически достоверная разница между исследуемой и контрольной группами (р<0,05, р<0,01), # – статистически достоверная разница между исследуемой и предшествующей экспериментальной группами (р<0,05, р<0,01); РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы, ВПФМ – время полимеризации фибрин-мономерных комплексов, CT – время коагуляции, CFT – время формирования сгустка, ML –максимальный лизис.

Как следует из данных, представленных в таблице, сразу после прекращения охлаждения в кровотоке животных регистрировалось увеличение количества тромбоцитов на 39 % (р<0,05) при снижении их агрегационной способности в 8 раз (р<0,01). Кроме того, достижение умеренной степени гипотермии сопровождалось гиперкоагуляцией, которая подтверждалась как данными тромбоэластограммы (показатель СТ уменьшался на 16 %, р<0,05), так и укорочением времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов на 35 % (р<0,05). Зафиксированная гиперкоагуляция усугублялась выраженным (на 40 %, р<0,05) снижением активности антитромбина III на фоне угнетения фибринолитической активности плазмы крови в 2 раза (р<0,01). Через 48 часов после прекращения охлаждения в кровотоке животных регистрировалось снижение количества тромбоцитов на 35 % (р<0,05), при увеличении их агрегационной способности в 18 раз от показателя зафиксированного сразу после прекращения охлаждения (р<0,05). Гиперкоагуляция, зарегистрированная у экспериментальных животных 1-ой группы, сохранялась. Кроме того, регистрировалось увеличение количества фибриногена, сопровождавшееся ростом концентрации РФМК. Состояние животных усугублялось значимым укорочением времени образования сгустка (на 31 %, р<0,05) и времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов (на 30 %, р<0,05).

Результаты исследования показателей микроциркуляторного русла, зарегистрированные в указанные периоды гипотермии у крыс, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели микроциркуляторного русла у крыс в различные периоды постгипотермии

Примечание: данные представлены в виде Ме – медиана выборки, [25÷75] – процентили выборки; * – статистически достоверная разница между исходными и регистрируемыми параметрами (р<0,05, р<0,01), # – статистически достоверная разница между исследуемой и предшествующей экспериментальной группами (р<0,05, р<0,01); ПМ – показатель микроциркуляции, СКО (σ) – флакс, среднеквадратичное отклонение амплитуд колебаний кровотока.

При оценке состояния микроциркуляторного русла сразу после прекращения охлаждения было зафиксировано увеличение в 2 раза (р<0,01) показателей микроциркуляции и флакса. Со стороны активных механизмов контроля микроциркуляции было установлено увеличение амплитуд эндотелиальных волн в 1,5 раза (р<0,01) и незначительное увеличение амплитуд вазомоторных волн на 25 % (р<0,05). Также регистрировалось увеличение дыхательных волн на 23 % (р<0,05). По истечении 2 дней после прекращения охлаждения регистрировалось резкое снижение показателя микроциркуляции в 3,5 раза (р<0,01). Кроме того, регистрировалось уменьшением амплитуд эндотелиальных и вазомоторных волн на 50 % и 40 % (р<0,05) соответственно. Кроме того, регистрировалось снижение амплитуд дыхательных и пульсовых волн в 5 и 6 раз соответственно (р<0,01).

Таким образом, в ходе достижения умеренной степени гипотермии у животных развивается вазодилатация, обусловленная как возможным первичным действием наркоза на прекапилляры, так и выбросом в кровоток оксида азота, в результате интенсификации кровообращения и увеличения напряжения сдвига на сосудистую стенку [8, 11, 12]. Выбросом оксида азота объясняется увеличение амплитуды эндотелиальных волн и снижение агрегационной активности тромбоцитов. На фоне развития вазодилатации увеличивается объем крови в микроциркуляторном русле, что сопровождается увеличением показателя микроциркуляции. Увеличение флакса обусловлено более интенсивным функционированием механизмов активного контроля микроциркуляции и свидетельствует о глубокой модуляции кровотока [10]. Увеличению показателя флакса также способствует рост амплитуды дыхательных волн, вызванный в свою очередь как увеличением микроциркуляторного давления, так и развившейся вазодилатацией. На фоне роста показателя микроциркуляции увеличение амплитуды дыхательных волн свидетельствует о снижении тонуса венулярных сосудов, об ухудшении оттока крови и развитии застойных явлений в микроциркуляторном русле [6, 7]. Развитие неблагоприятных гемодинамических сдвигов у экспериментальных животных в данный период усугубляется развитием гиперкоагуляционных изменений со стороны системы гемостаза. Множество клинических работ характеризует гипотермию как фактор развития тромбоза у пострадавших [2, 3, 4, 10]. Так, при исследовании людей, подвергшихся гипотермическому воздействию, отмечено развитие полицитемии и гиперкоагуляционных сдвигов, обусловленных гемоконцентрацией вследствие увеличения проницаемости сосудов [2, 6, 8]. При исследовании крыс, достигших ректальной температуры +28...+32°С, регистрируется возросшая концентрация PAI, оказывающего протромботический эффект, максимальная концентрация которого достигается при +31 °С [10]. Аналогичные изменения были обнаружены в экспериментах на мышах при охлаждении до +31 ºС. В ходе экспериментов было показано значимое увеличение концентрации PAI-1, что расценивалось как возросший риск развития тромбоза у экспериментальных животных [3, 10]. Также, при общей непреднамеренной гипотермии у людей, достигших +30 °С в течение 30 минут, отмечено угнетение активности t-PA, сопровождающееся депрессией фибринолиза [10]. В то же время описанные протромботические изменения в системе гемостаза являются целесообразной реакцией организма. Так, при гипотермии происходит «физиологическая ампутация» с последующим развитием ишемических поражений в переохлажденных конечностях, гиперкоагуляционный статус и депрессия фибринолиза обеспечивают отграничение пораженного участка, в то время как гипоагреация способствует сохранению реологических свойств крови при развившейся гемоконцентрации.

В клиническом течении гипотермии выделяют постгипотермический период, характеризующийся формированием и манифестацией травматических последствий действия общего переохлаждения на организм. По статистическим данным самое большое число летальных исходов регистрируется в первые 48 часов после возращения температуры тела к нормальным значениям [9, 10].

По истечении 2-х суток с момента прекращения охлаждения нами зарегистрировано выраженное снижение амплитуд волн всех частотных диапазонов, что свидетельствует о развитии массивного вазоспазма [12, 13]. На фоне предварительного охлаждения развитие вазоспазма уменьшает несоответствием между потребностью в кислороде и объемом поступающего кислорода к тканям, что показано в исследованиях на собаках и на людях [11, 13]. Увеличение тонуса и развитие спазма сосудов объясняется возросшей симпатической импульсацией в постгипотермическом периоде, вызванной активацией стресс-реакции, это приводит к увеличению напряжения в гладкомышечных клетках сосудистой стенки. Сформировавшийся спазм приводит к обеднению нутритивного кровотока, развитию ишемии и снижению показателя перфузии. Первичное нарушение микроциркуляции, способствующее увеличению сопротивления току крови, вследствие вазоспазма, является причиной вторичных нарушений в системе гемостаза. Вазоспазм, ишемические явления, а также непосредственное действие гипотермии на организм стимулируют выброс в кровоток провоспалительных цитокинов, обладающих мощным прокоагулянтным действием [3, 7]. Так, показано, что в первые 24–48 часов регистрируется максимально возможный уровень фактора некроза опухоли (TNFα), интерлейкинов 6 и 18 (IL-6, IL-18), обладающих мощным прокоагулянтным действием [2, 7]. Дополнительным стимулятором процессов свертывания крови является развивающийся в постгипотермическом периоде ацидоз [13]. В нашем исследовании активация системы свертывания подтверждается развитием состояния тромботической готовности у экспериментальных животных, которое характеризуется гиперагрегацией, гиперкоагуляцией, появлением в кровотоке растворимых фибрин-мономерных комплексов и укорочением времени их самосборки. Кроме того, по данным тромбоэластограммы регистрировалось укорочение времени образования сгустка. В пользу предположения о развитии острой фазы воспалительной реакции говорит начальное увеличение концентрации фибриногена.

Выводы:

1. Достижение умеренной степени гипотермии оказывает выраженное модулирующее влияние на систему микроциркуляции. Сразу по достижении указанной степени гипотермии наблюдалось развитие вазодилатации, свидетельствующее о декомпенсаторном состоянии экспериментальных животных.
2. Превентивная терапия для улучшения гемостазиологической картины в постгипотермический период должна быть направлена на профилактику тромботических осложнений.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60054 мол_а_дк 

Библиографическая ссылка