Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БОЛЕЗНИ КРОНА И ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Осиков М.В. 1 Симонян Е.В. 1 Бакеева А.Е. 1 Костина А.А. 1
1 ФГБОУ ВО "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Минздрава России
Во всем мире наблюдается стойкий рост частоты хронических заболеваний кишечника, наиболее тяжелыми и распространенными из которых являются воспалительные заболевания кишечника – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Этиология и патогенез БК и ЯК до настоящего времени точно не установлены, а применяемая лекарственная терапия не приводит к излечению и имеет множество побочных эффектов, что ограничивает её использование. В связи с этим важным является дальнейшее изучение патогенеза БК и ЯК, а также разработка и доклиническая апробация новых подходов к диагностике и лечению. Это возможно в условиях экспериментального моделирования БК и ЯК у животных. Цель работы – провести критический анализ данных об известных методах экспериментального моделирования БК и ЯК, индексированных в рецензируемых источниках баз данных Pubmed и Российского индекса научного цитирования за период 2006–2015 гг. Экспериментальная модель ЯК и БК должна быть максимально приближена к ВЗК у человека по клинической, морфологической, иммунологической и гематологической картине. Важными требованиями к моделям являются простота, скорость постановки и низкая стоимость. Выявлено два основных подхода при моделировании ВЗК: с использованием трансгенных животных с нокаутированными генами, продукты которых занимают ключевые позиции в патогенезе (STAT4, STAT73, ИЛ-7, CD40+), а также химически индуцированные модели (декстрана сульфат натрия, тринитробензолсульфоновая кислота, динитробензолсульфоновая кислота, уксусная кислота). Критический анализ экспериментальных моделей ВЗК позволил обозначить наиболее оптимальные подходы – для ЯК модель с 4 % уксусной кислотой, для БК – модель с динитробензолсульфоновой кислотой.
болезнь Крона
язвенный колит
воспалительные заболевания кишечника
экспериментальное моделирование.
1. Абдулхаков С.Р., Абдулхаков А.С. Неспецифический язвенный колит: современные подходы к диагностике и лечению // Вестник современной клинической медицины. – 2009. – Т. 2, вып. 1. – С. 32-41.
2. Биологическая терапия воспалительных заболеваний кишечника / В. И. Совалкин [и др.] // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2010. – №. 3. – С. 83-84.
3. Григорьева Г.А., Мешалкина Н.Ю. Болезнь Крона. – М.: Медицина, 2007. – 184 с.
4. Деркач Н.В., Малоштан Л.Н., Анас Фаттал. Изучение влияния феносина на течение экспериментального язвенного колита у крыс // Медицина и образование в Сибири. – 2015. – №. 3. – С.10.
5. Конович Е.А., Халиф И.Л., Шапина М.В. Иммунопатогенез воспалительных заболеваний кишечника// РЖГГК. – 2013. – Т.23. – № 4. – С.69-78.
6. Морфофункциональное обновление эпителиальных клеток толстой кишки и апудоцитов в патогенезе и прогнозировании течения неспецифического язвенного колита / А. М. Осадчук [и др.] // Клиническая медицина. – 2006. – Т. 84, №. 12. – С. 35-39.
7. Неспецифический язвенный колит / Н. Т. Ватутин [и др.] // Архивъ внутренней медицины. – 2015. – №. 4 (24). – С.62.
8. Осиков М.В., Телешева Л.Ф., Агеев Ю.И. и др. Патофизиологические аспекты изменения и коррекцииврожденного иммунитета при хронической почечной недостаточности // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – №. 5. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=7450 (дата обращения: 08.08.2016).
9. Полуэктова Е.А., Ляшенко О.С., Королев А.В. Механизмы, обеспечивающие взаимодействие бактериальных клеток с организмом хозяина, и их нарушение у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2014. – № 5. – С. 42–53.
10. Рахимова О.Ю., Юрков М.Ю., Митрофанова И.П., Пайзуллаева З.К. Воспалительные заболевания кишечника // Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., ред. Руководство по гастроэнтерологии. – М., 2010. – С. 379-408.
11. Халиф И.Л. Воспалительные заболевания кишечника (неспецифический язвенный колит и болезнь Крона): клиника, диагностика и лечение. – М.: Миклош, 2008.
12. Циммерман Я.С. Классификация основных гастроэнтерологических заболеваний и синдромов. – 3-е изд. – Пермь: ПГМА, 2012.
13. Язвенный колит и болезнь Крона у детей: новые подходы к лечению / Э.Н. Федулова [и др.] // Медицинский альманах. – 2008. – №.5. – С. 160.
14. Anti-inflammatory and anti-angiogeniceffect of long chain n-3 polyunsaturated fatty acids in intestinal microvascular endothelium / Ibrahim A. [et al.] // Clin. Nutr. – 2011. – №. 30. – P. 678-687.
15. Barnett M. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic / M. Barnett, A. Fraser // Ulcerative Colitis – Treatments, Special Populations and the Future. – 2011. – No.2. – P. 161–165.
16. Baumgart D.C., Sandborn W.J. Crohn’s disease // Lancet. – 2012. – №. 380. – P. 590–605.
17. Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis/ Alex, P. [et al.] // Inflam. Bowel Dis. – 2009. – Vol.15, No.3. – P. 341-352.
18. Inflammatory Bowel Disease, ed. by SR Targan et al. – UK.: Wiley-Blackwell, 2010. – Ch. 11. – Р. 157–170.
19. Investigation of two models of trinitrobenzenesulfonic acid-induced colitis in rats / Marinov V.[et al.] // Trakia Journal of Sciences. – 2015. – Vol. 13, Suppl. 2. – P. 49-54.
20. Minaiyan M. Effects of extract and essential oil of Rosmarinus officinalis L. on TNBS-induced colitis in rats. / M. Minaiyan, A. Ghannadi, P. AfsharipourMahzouni // Res Pharm Sci. – 2011. – No. 6. – P. 13-21.
21. Morampudi, V. DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat./ V. Morampudi [et al.] // J. Vis. Exp. – 2014. – №. 84.URL: http://www.jove.com/video/51297/dnbstnbs-colitis-models-providing-insights-into-inflammatory-bowel (дата обращения: 06.08.2016).
22. Novel features of the rat model of inflammatory bowel disease based on 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid-induced acute colitis / Szalai Z.[et al.] //Acta Biologica Szegediensis. – 2014. – Vol. 58(2). – P. 127-132.
23. Sotnikova R. Efficacy of quercetin derivatives in prevention of ulcerative colitis in rats / R. Sotnikova, V. Nosalova, J. Navarova // Interdisciplinary Toxicology. – 2013. – Vol. 6(1). – P. 9-12.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК): язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) – одна из самых значимых проблем современной гастроэнтерологии. Постоянный рост заболеваемости, инвалидизация населения, а также большая распространенность подавляющего числа случаев среди трудоспособного населения в возрасте 20–40 лет, делает данную группу заболеваний социально значимой [2]. БК – это рецидивирующее системное воспалительное заболевание, которое может поражать любую часть гастроинтестинального тракта, сопровождаться экстраинтестинальными проявлениями и ассоциированными иммунными нарушениями [16]. ЯК – это хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки толстой кишки неизвестной этиологии с развитием в ней язвенно-некротических изменений, локализованное преимущественно в ее дистальных отделах, поражающее первоначально прямую кишку с последующим распространением в проксимальном направлении и в 10 % случаев захватывающее всю толстую кишку (редко – с рефлюксным леотифлитом); протекает с различными местными и системными осложнениями и внекишечными проявлениями [12].

Распространенность ЯК в мире составляет 4–20 случаев на 100000 населения, в России – 1,7 случаев на 100000 населения. Распространенность БК в мире составляет 2–8 случаев на 100000 населения, в России – 0,3 случая на 100000 населения [1, 2].

Считается, что БК возникает в результате взаимодействия внешних и внутренних факторов. Происходит местное повреждение тканей кишечника и, как следствие, развитие локального воспаления в различных отделах ЖКТ. Генетически детерминированность способности иммунной системы регулировать воспалительные реакции подтверждена установленной связью между системой главного комплекса гистосовместимости (HLA) и БК. Зачастую в основе патогенеза БК лежат иммунные механизмы, которые несут ответственность за состояние эпителиального барьера кишечной стенки. Согласно лимфатической теории, первичные изменения развиваются в лимфатических узлах брыжейки и лимфоидных фолликулов кишечной стенки, что ведет к лимфатическому отеку подслизистого слоя, завершающемуся деструкцией и гранулематозом кишечной стенки [3].

Этиология язвенного колита до конца не изучена. Существует генетическая предрасположенность к НЯК (семейные случаи язвенного колита). Имеются данные о связи НЯК с антигеном DR2 и В27 комплекса гистосовместимости HLA. В патогенезе имеют значение изменения иммуногистологической реактивности, дисбиотические сдвиги, аллергические реакции, генетические факторы, нервно-психические нарушения, большое значение придают аутоиммунизации. Последнее можно подтвердить обнаружением при язвенном колите аутоантител, характером клеточного инфильтрата, который отражает реакцию ГЗТ. Также обнаруживают трофические расстройства в связи с выраженной деструкцией интрамурального нервного аппарата кишки. Активно исследуется роль при ЯК и БК условно-патогенной микрофлоры, которая непрерывно стимулирует иммунную систему кишечника и приводит к возникновению местной аллергической реакции [6, 9, 10, 11, 22].

Отсутствие четких представлений об этиологии и патогенезе ЯК и БК приводит к проблемам в диагностике и в большей степени в лечении ВЗК даже при наличии широкого спектра применяемых лекарственных средств. Течение БК и ЯК приводит к тяжелым осложнениям, в 1,5 раза увеличилась частота формирования патологического процесса в раннем возрасте, появились более тяжелые внекишечные проявления, чаще наблюдается развитие резистентности к традиционной терапии, ранняя инвалидизация пациентов, что требует разработки новых терапевтических подходов [2, 13]. Экспериментальное моделирование патологии человека является актуальной проблемой современной медицины и эффективно используется для разработки новых терапевтических подходов [8]. Для апробации новых лекарственных средств с патогенетически обоснованным механизмом действия возникает необходимость в моделировании ЯК и БК.

Цель работы – провести критический анализ данных об известных методах экспериментального моделирования БК и ЯК, индексированных в рецензируемых источниках баз данных Pubmed и Российского индекса научного цитирования за период 2006-2015 гг. Выявить наиболее оптимальную экспериментальную модель ЯК и БК по клинической, морфологической, иммунологической, гематологической картине. Важными требованиями к моделям ЯК и БК являются простота, скорость постановки и низкая стоимость.

Моделирование ЯК. Можно выделить два основных подхода при моделировании как ЯК, так и БК.

1. В последние 10–20 лет разработаны экспериментальные модели ВЗК, которые развиваются спонтанно у мышей с определенным генотипом или в результате воздействия на геном (нокаутные, трансгенные мыши) и ассоциированы с утратой иммунной толерантности к аутологичной кишечной микрофлоре.

Утрата компонентов эпителия кишечника (кератин 8-дефицитные мыши), слизи (муцин 2-дефицитные мыши), транспортного белка (мыши с дефицитом гена 1а множественной лекарственной резистентности). ВЗК этой группы развиваются при воздействиях на адаптивную иммунную систему и вызывают активацию эффекторной функции CD4+ Т-лимфоцитов. Одной из таких моделей являются STAT4 трансгенные мыши (STAT4 – фактор транскрипции, который активирует гены иммунного ответа типа Th1 с увеличением продукции IFN-γ). У мышей этой линии после дополнительной активации иммунной системы антигеном гемоцианином через 7–14 дней развивается энтероколит с глубоким трансмуральным воспалением и плотным инфильтратом CD4+ T-клеток, продуцирующих IFN-γ и ФНО-α. Перенос активированных бактериальными антигенами CD4+ T-клеток этих мышей иммунодефицитным реципиентам вызывал развитие колита.

Другие варианты ВЗК этого типа наблюдаются при стимуляции роста незрелых и зрелых лимфоцитов, их дифференцировки c развитием патогенной эффекторной функции, в частности, при высокой экспрессии ИЛ-7 (ИЛ-7-трансгенные мыши) или лиганда CD40 на лимфоцитах (СD40-лигандтрансгенные мыши), который активирует клетки, несущие рецептор CD40 («наивные» Т-клетки, B-клетки, макрофаги, моноциты) с увеличением продукции провоспалительных цитокинов. В последнем случае развивалось мультиорганное воспаление, включая энтероколит, который воспроизводился при переносе CD4+ T-клеток от больных мышей [18].

Выключение сигнальных молекул, ведущее к нарушению баланса между про- и противовоспалительными цитокинами (A20-дефицитные мыши, STAT73–/–-дефицитные мыши) и др. В течение 5–12 недель у мышей развиваются различные по локализации и тяжести варианты энтероколита или колита с инфильтрацией стенки кишечника иммунокомпетентными клетками (нейтрофилы, CD4+ T-клетки, B-клетки и др.) и увеличением продукции провоспалительных цитокинов IFN-γ, ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-12, хемокинов и их рецепторов [18].

2. Химически индуцированные модели с использованием декстрана сульфата натрия (ДСН), тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС) и динитробензолсульфоновой кислоты (ДНБС), 4 % и 10 % уксусной кислоты [14, 15, 20, 23].

Учитывая низкую стоимость и быстроту постановки, химически индуцированные модели являются предпочтительными в экспериментальных исследованиях ВЗК. Безусловно, каждая модель характеризуется рядом ограничений и недостатков наряду с достоинствами и преимуществами, исходя из этого возникает необходимость сравнительного анализа экспериментальных моделей:

2.1. Модель с введением ДСН – одна из наиболее часто используемых при моделировании ЯК у грызунов. Поглощение мышами 3–10 % ДСН, растворенного в питьевой воде, в течение 7–10 дней индуцирует клинические признаки ЯК: потерю веса, кровавую диарею; морфологические признаки: укорочение ободочной кишки, изъязвление слизистой оболочки, уменьшение числа бокаловидных клеток, крипт и их глубины, инфильтрацию лимфоцитами, плазмоцитами и гистоцитами. [15]. Модель достаточно удобна для исследования эффективности лекарственных препаратов, изучения механизмов эпителиальной регенерации, влияния врожденного иммунитета на гомеостаз слизистых оболочек и исследования роли ЯК в развитии интестинальной дисплазии и аденокарциномы.

2.2. Альтернативой использованию ДСН является модель с введением ДНБС. Она подразумевает ректальное введение 100 мг/кг ДНБС, предварительно растворенного в 50 % спирте этиловом, присутствие которого необходимо для улучшения проникновения веществ через эпителий в собственную пластинку слизистой оболочки кишечника. Данная модель ассоциирована с такими клиническими и морфологическими проявлениями, как кровавая диарея, потеря веса, истончение кишечной стенки, изъязвление слизистой оболочки, уменьшение количества крипт, нейтрофильная инфильтрация. Однако указанные морфологические признаки локализуются преимущественно в дистальном отделе кишечника, что характерно больше для БК, а не для ЯК [15, 19, 23].

2.3. Введение ТНБС при моделировании ЯК очень схоже с моделью с использованием ДНБС. Ректально вводится 100 мг/кг вещества, предварительно растворенного в 50 % спирта этилового. Морфологическая картина модели также более характерна для БК, чем для ЯК [23].

2.4. Следующая модель подразумевает индуцирование ЯК ректальным введением на глубину 8 см 1 мл 4 % уксусной кислоты. Использование уксусной кислоты при моделировании ЯК – один из наиболее широко применяемых методов моделирования. В результате введения уксусной кислоты в полость кишечника наблюдаются клинические признаки: кровавая диарея, потеря веса; морфологические признаки: интенсивный воспалительный ответ, характеризующийся масштабным кровотечением, очаговыми изъязвлениями, истончением кишечной стенки, уменьшением количества крипт, нейтрофильной инфильтрацией [21]. Ректальное введение уксусной кислоты для моделирования ЯК возможно и в 10 % концентрации, но в меньшем объеме – 0,5 мл. В результате наблюдаются клинические признаки интоксикации, диарея с примесью слизи и крови, снижение массы тела животных; морфологические признаки: выраженная гиперемия и отек слизистой оболочки, интенсивные кровоизлияния, многочисленные участки некроза [4].

Однако у рассмотренных нами моделей существует и ряд недостатков:

  1. Широкая вариабельность концентраций при пероральном использовании ДСН приводит к невозможности контроля объема поглощенного раствора животными и массы поступившего в ЖКТ ДСН. Это приводит к разнородности повреждений слизистой стенки кишечника по глубине и площади распространения. Следствием является широкий разброс результатов эксперимента.
  1. Применение ДНБС и ТНБС воспроизводит клиническую картину ЯК, однако симптомы могут варьировать в зависимости от используемых животных, частоты введения, дозы ДНБС и ТНБС. По всем признакам использование ДНБС и ТНБС лучше воспроизводит БК, а не ЯК [17]. Неоспоримым преимуществом ДНБС и ТНБС по сравнению с ДСН является низкая стоимость.
  2. Использование 4 % уксусной кислоты, помимо хорошей воспроизводимости признаков ЯК, удобства и простоты метода, характеризуется доступностью вещества и экономическим преимуществом. Введение 10 % уксусной кислоты приводит к развитию выраженных деструктивных изменений слизистой стенки кишечника, что часто приводит к осложнениям в виде кишечных кровотечений, перфорации стенки и перитониту, что увеличивает частоту летальных исходов.

Моделирование БК. Наряду сЯК БК целесообразно моделировать с использованием химически индуцированных моделей в связи с их доступностью и относительной простотой. Несмотря на схожесть изучаемых патологий, при моделировании БК присутствуют некоторые особенности.

  1. Модель с использованием 1–3 % раствора ДСН, растворенного в питьевой воде, поглощаемого животными в течение 7 дней, применима не только для постановки ЯК, но и для БК с характерными клиническими проявлениями: кровавая диарея, потеря веса, морфологическими проявлениями: эрозии слизистой оболочки, уменьшение количества крипт, присутствие большого количества лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов в подслизистой оболочке. Достоинством данной модели является возможность продемонстрировать поверхностные повреждения в острой, хронической стадии и в стадии ремиссии. Однако использование ДНС не позволяет в полной мере воспроизвести морфологические признаки (трансмуральное воспаление и некроз в стенке кишечника) при БК. В этом отношении предпочтительно использование ДНБС или ТНБС [17].
  2. Использование ДНБС для моделирования БК подразумевает ректальное введение 15–30 мг вещества, предварительно растворенного в 50 % этаноле через катетер длиной 8 см. Преимуществом является стремительное формирование уже на третьи сутки после введения вещества признаков воспаления, изъязвлений преимущественно в дистальном отделе кишечника, что характерно для БК. Клинические признаки включают потерю веса, кровавую диарею, морфологические признаки – истончение кишечной стенки, изъязвление слизистой оболочки, адгезия кишечника к близлежащим органам (мочевой пузырь), инфильтрация лимфоцитами и нейтрофилами, уменьшение количества крипт, обширный отек в дистальной части кишечника; иммуногистохимически выявляется повышение активности миелопероксидазы в лейкоцитах, инфильтрирующих стенку кишечника. Хотя для всех моделей БК характерно явное проявление разрушений кишечной стенки, Применение ДНБС и ТНБС по сравнению с другими агентами более точно воспроизводит морфологическую картину БК, наблюдаемой у человека. Использование ДНБС в моделировании БК экономически более выгодно в сравнении с ТНБС, что является важным преимуществом при выборе экспериментальной модели [17, 20]. В целом, модель БК с использованием ТНБС отличается простотой и быстротой проведения эксперимента, может быть использована у разных видов животных (крысы, мыши, свиньи, кролики). Применение ДНБС позволяет более точно рассчитать массу поглощенного вещества, обеспечивает меньший разброс результатов эксперимента, уменьшает разнородность результатов проведенного эксперимента в сравнении с использованием ДНС, а также экономически более выгодно в сравнении с ТНБС [23].
  3. ТНБС при моделировании БК вводится ректально в дозе 10 или 30 мг вещества, растворенного в 50 % этаноле, через катетер, длиной 8 см. Максимальный объем вводимого раствора составляет для половозрелой крысы 1 мл. В течение 24, 48, 72 часов после введения вещества наблюдались такие клинические признаки, как потеря веса, кровавая диарея, уменьшение аппетита [5]. Большая потеря веса наблюдалась у животных, которым было введено 30 мг вещества, чем у животных с введением 10 мг [23]. При вскрытии животных на 10 день эксперимента были отмечены морфологические признаки БК: трансмуральное воспаление с макрофагальной инфильтрацией, обширными язвами по всей длине сегмента, контактирующего с веществом (8 см), разрушение тканей; иммуногистохимические признаки: увеличение экспрессии IL-6, IL-1, TNF-α.

Таким образом, наиболее оптимальным подходом для моделирования ЯК является ректальное введение 4 % уксусной кислоты. Наиболее удобным и приемлемым подходом для моделирования БК является ректальное введение ДНБС.


Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Симонян Е.В., Бакеева А.Е., Костина А.А. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БОЛЕЗНИ КРОНА И ЯЗВЕННОГО КОЛИТА // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 4. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25072 (дата обращения: 22.10.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074