Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Мягкова М.А. 1 Морозова В.С. 1

---

1 Институт физиологически активных веществ РАН

Проведено исследование диагностической возможности определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека на основе использования в ИФА новых синтетических антигенов с оптимальным замещением (10-15%) гаптеном высокомолекулярной матрицы. При выбранных условиях ИФА проводили определение содержания антител IgG и IgM класса в индивидуальных сыворотках здоровых лиц и больных аллергическим поллинозом, нейродермитом, опийной наркоманией. У пациентов, входящих в группу больных, происходит одновременное изменение уровня антител IgG и IgM класса. Для больных опийной наркоманией отмечено достоверное повышение содержания антител IgM класса к серотонину и гистамину (р<0,05). Для группы больных аллергическим поллинозом и нейродермитом характерно достоверное (р<0.05) понижение содержания IgM антител к серотонину и гистамину. Установлена взаимосвязь между содержанием естественных антител к указанным нейромедиаторам и течением патологических процессов. Естественные антитела выполняют в норме гомеостатическую или защитную функцию, поддерживая концентрации различных эндогенных соединений в пределах нормы.

Статья в формате PDF

141 KB

антитела

диагностические маркеры

опиоидные пептиды

биогенные амины

иммунохимические свойства.

1. Мягкова М.А., Морозова В.С. Естественные антитела и их физиологические функции // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. – 2014. – № 3. – С.75-81.

2. Мягкова М.А. Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям. – М.: МГУЛ, 2001. – 268 с.

3. Мягкова М.А., Дудко Т.Н., Панченко Л.Ф., Петроченко С.Н. Определение естественных антител к эндогенным биорегуляторам у больных игроманией методом иммуноферментного анализа // Наркология. – 2006. – № 12. – С. 39-42.

4. Полетаев А.Б. Физиологическая иммунология (естественные аутоантитела и проблемы наномедицины). – M.: Миклош, 2011. – 219 c.

5. Elluru S.R. et al. Modulation of human dendritic cell maturation and function by natural IgG antibodies // Autoimmun. Rev. – 2008. – V. 7(6). – P. 487-90.

6. Han B.W., Herrin B.R., Cooper M.D., Wilson I.A. Antigen recognition by variable lymphocyte receptors // Science. – 2008. – V. 321(5897). – P.1834-7.

7. Madi A. et al. Organization of the autoantibody repertoire in healthy newborns and adults revealed by system level informatics of antigen microarray data.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – V. 106. – P. 14484-9.

8. Mostafa G.A., Ibrahim D.H., Shehab A.A., Mohammed A.K. The role of measurement of serum autoantibodies in prediction of pediatric neuropsychiatric systemic lupus erythematosus // J. Neuroimmunol. – 2010. – V. 227. – pp. 195-201.

9. Van Ree R., Aalberse R.C. Rabbit IgG directed to a synthetic C-terminal peptide of the major grass pollen allergen Lol p I inhibits human basophil histamine release induced by natural Lol p I. // Int Arch Allergy Immunol. – 1995. – V.106. – No. 3. – pp. 250-257.

Создание диагностических тестов определения и мониторинга эндогенных биорегуляторов является актуальной задачей, важное место в которой занимает вопрос разработки оптимальных программ лабораторного контроля процесса заболевания, позволяющего прогнозировать осложнения [1,4,8]. Для этой цели используют наиболее технологичные и удобные в лабораторной практике способы иммуноанализа, ключевым составляющим реагентом которого являются антитела. В последние годы расширились диагностические возможности применения антител для оценки изменения содержания эндогенных биорегуляторов [3,9]. Помимо классических методов иммуноанализа, в которых используют антитела, созданные по технологии иммунизации животных, получили развитие методы определения естественных антител к биомолекулам различного вида [5]. Данные литературы свидетельствуют о том, что важной составной частью циркулирующих иммуноглобулинов являются естественные антитела (е-AT). Они способны принимать участие в широком спектре физиологических реакций организма: от иммунного регулирования, обеспечения внутреннего гомеостаза, неспецифической барьерной роли против чужеродных патогенных антигенов, до транспортной функции и модуляции действия биологически активных веществ [2,6]. Показано, что при патологических состояниях происходит изменение нормального уровня е-AT, которое, как правило, связано с нарушением метаболизма того или иного ключевого эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания [7]. Одним из перспективных методов оценки процесса течения заболевания является исследование е-AT к нейромедиаторам в сыворотке крови, которые дают объективную оценку системы тяжести при различной патологии [8].

Цель данной работы заключалась в разработке метода определения естественных антител к нейромедиаторам (сротонину, гистамину, дофамину, дерморфину, β –эндорфину) в сыворотке крови больных с аллергическими расстройствами и болезненной зависимостью, проведении сравнительного исследования их содержания и установлении возможности диагностического применения.

Материалы и методы

Для исследования получены образцы сыворотки крови 70 больных нейродермитом в возрасте от 18 до 34 лет со средней продолжительностью заболевания 7,0±1,5 лет в отделе иммунологии ГУ ЦНИКВИ Росздрава. Образцы сыворотки крови для исследования 55 больных в возрасте от 19 до 54 лет и продолжительностью заболевания в среднем 7.9±1.2 лет с диагнозом поллиноз предоставлены Клинической больницей № 4 г. Пенза. Московским научно-практическим центром наркологии г. Москвы предоставлены пробы сыворотки крови 25 больных опийной наркоманией, в возрасте от 20 до 44 лет и продолжительностью заболевания от 1 года до 11 лет. При проведении иммунохимических исследований в качестве контрольных образцов использовали сыворотки крови 25 здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет, полученные в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН.

Результаты исследований оценивали с использованием средней арифметической величины (М), их стандартной ошибки (m), критерия Стьюдента – Уэлча (t), критерия Пирсона, коэффициента корреляции Кендалла. Для принятия гипотезы применяли уровень достоверности 95 % (p=0,05).

Получение конъюгата нейромедиатора на основе полимерной матрицы.

Синтез конъюгированных антигенов нейромедиаторов (сротонина, гистамина, дофамина, дерморфина, β –эндорфина) на основе поли (4-нитрофенил) акрилата выполняли следующим образом. К раствору 6 мг (0.036 ммоль) поли(4-нитрофенил) акрилата в 1 мл ДМФА_абс, добавляли 1.1 мг (0.009 ммоль) соответствующего нейромедиатора. В результате был получен конъюгат гистамина, содержащий 13 молей гаптена на моль полимерного носителя.

ИФА определения антител к сротонину, гистамину, дофамину, дерморфину, β –эндорфину в сыворотке крови человека.

Планшет сенсибилизировали раствором конъюгированного антигена соответствующего нейромедиатора (по 100 мкл в лунку) в 2 мкг/мл концентрации в 0.02 М карбонатном буфере (рН 9.5) в течение 18 часов при температуре 4 °С. После сорбции планшет отмывали трижды (3*100 мкл) 0.005 % раствором твин-20 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (рН 7.2), и вносили в лунки в двух повторах по 100 мкл исследуемой сыворотки в растворе ЗФР, содержащем 0.01 % твин-20, в разведении 1/200. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 °С. Отмывали, как описано выше, и добавляли в лунки по 100 мкл раствора антивидовых антител либо против IgG, либо против IgM человека, меченные пероксидазой хрена в разведении 1/2000. Учёт результатов проводили на спектрофотометре при длине волны 450 нм. На основании результатов ИФА проводили анализ содержания антител IgG и IgM класса в индивидуальных сыворотках больных и доноров, определяя достоверное изменение уровня антител.

Обсуждение полученных результатов

На первом этапе работы провели анализ структуры новых антигенов для разработки иммуноферментного метода. Конъюгированные антигены биогенных аминов и опиоидных пептидов синтезировали с использованием полимерной матрицы, путём конденсации исходных соединений, содержащих свободную аминогруппу, с поли(4-нитрофенил)акрилатом. Получены конъюгаты, содержащие различное замещение (100 %, 50 %, 30 %, 10–15 %) молекул лиганда, связанных с макромолекулярным носителем.

При разработке ИФА определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам использовали указанные выше синтезированные конъюгированные антигены с различным замещением полимерной матрицы молекулами гаптена (таб.1). Это связано с тем, что при определении антител к любому из исследуемых антигенов на начальном этапе, мы изучали влияние структуры искусственного антигена на полноту связывания в ИФА с гетерогенной популяцией иммуноглобулинов, присутствующих в сыворотке крови человека. В результате обнаружено, что из всего разнообразия синтезированных конъюгированных антигенов, комплексы с 10–15 % замещением полимерной матрицы биогенных аминов и опиоидных пептидов являются наиболее пригодными для определения всей популяции специфических иммуноглобулинов, которые, как известно, различаются по силе связывания с антигеном и содержанию в каждой индивидуальной сыворотке крови человека.

Таблица 1

Характеристика полученных антигенов

Следующий раздел посвящён разработке ИФА определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови пациентов. В таблице 2 приведены обобщённые данные, полученные при анализе результатов подбора условий выполнения ИФА для определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам, на основании которых выбирали область линейной зависимости величины поглощения в ИФА, как от концентрации исследуемого антигена, так и от разведения анализируемой сыворотки.

Таблица 2

Условия проведения ИФА для определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в анализируемых образцах сыворотки крови

На основании выбранных условий ИФА проводили определение содержания антител IgG и IgM класса в индивидуальных сыворотках здоровых лиц и больных аллергическим поллинозом, нейродермитом, опийной наркоманией. Результаты анализа показали, что уровень антител к исследуемым антигенам у больных достоверно отличается от нормы, установленной в группе доноров (среднедонорское значение в ИФА±3σ). Причём, необходимо отметить, что у пациентов, входящих в группу больных, происходит одновременное изменение уровня антител IgG и IgM класса, что свидетельствует о том, что иммунная система в ответ на изменение метаболизма ключевых биорегуляторов, сопровождающих развитие патологических процессов, участвует в поддержании гомеостаза, регулируя содержания е-АТ к биогенным аминам и опиоидным пептидам. Проведённая статистическая обработка полученных данных позволила выявить некоторые закономерности. Так, установили, что в целом по группе в зависимости от характера изменения уровня антител к исследуемому антигену больных можно условно подразделить на три категории: группа с пониженным, с повышенным и соответствующим норме содержанием антител (таб. 3).

Таблица 3

Количество больных (в %) с измененным уровнем антител при различных аллергических заболеваниях

Оценку изменения уровня естественных антител IgG и IgM класса провели на более обширном клиническом материале – у больных с патологиями нервной и иммунной системы (наркомания, аллергический поллиноз, нейродермит). Результаты сравнительного определения специфичности взаимодействия антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам: энкефалинам, β-эндорфину, дерморфину и структурным аналогам этих веществ представлены в таблице 4.

Таблица 4

Данные ИФА выявления антител IgM класса к опиоидным пептидам и биогенным аминам в сыворотке крови больных и доноров

*p<0,05

Для группы обследованных больных содержание антител IgM класса было наиболее информативным и позволяло обнаружить высокий процент пациентов с достоверным изменением уровня антител по сравнению с нормой. Наблюдается специфическое увеличение уровня антител IgM класса, связывающих дерморфин, β-эндорфин, энкефалин (р<0.05). Содержание антител к ряду аналогов дерморфина в целом по группе достоверно не отличалось от нормы. Интересные результаты были получены при анализе содержания IgM антител специфичных к опиоидным пептидам для больных аллергическим поллинозом. В этой группе выявлено достоверное снижение нормального уровня е-АТ, связывающих все исследуемые эндогенные опиоидные пептиды. Более того, это снижение было высокоспецифичным именно для эндогенных нейропептидов, поскольку в среднем по группе не было обнаружено достоверных различий для антител IgM класса, связывающих синтетические аналоги дерморфина. В группе больных нейродермитом отмечается тенденция к снижению содержания e-АТ к эндогенным опиоидным пептидам. Но достоверной разницы по сравнению с группой доноров не установлено. Для больных опийной наркоманией можно наблюдать достоверное повышение содержания антител IgM класса к серотонину и гистамину (р<0,05). Полученный факт подтверждает известные данные об участии серотониннергической системы в развитии зависимости к наркотикам. Приём наркотика ведёт к повышенному выбросу серотонина, который в свою очередь оказывает влияние на синтез специфических иммуноглобулинов, способных, вероятно, выполнять компенсаторную функцию и регулировать концентрацию данного соединения. Для группы больных аллергическим поллинозом и нейродермитом характерно достоверное (р<0.05) понижение содержания антител IgM класса к серотонину и гистамину.

Заключение. Из совокупности представленных данных о содержании е-АТ к биогенным аминам и опиоидным пептидам в норме и клинике заболеваний следует, что уровни этих антител изменяются при патологических процессах, связанных с нарушениями обмена их антигенных мишеней и, возможно, индуцированы этими нарушениями. Причём, изменения уровней е-АТ происходят таким образом, чтобы компенсировать патологические отклонения в метаболизме антигенов и тем самым нейтрализовать их патогенетическое действие (если антигены биологически активны). Это позволяет сделать предположение, что е-АТ выполняют в норме гомеостатическую или защитную функцию, поддерживая концентрации различных эндогенных соединений в пределах нормы. Патологическая роль е-АТ, по-нашему мнению, может проявляться лишь при их чрезмерной продукции, связанной, возможно, с нарушением регуляции их синтеза, и может рассматриваться в этом случае, как симптом аутоиммунного расстройства; или, наоборот, при недостаточной их продукции, в результате специфического иммунодефицита (у больных нейродермитом и аллергическим поллинозом). В этом случае проявляется патологическая роль не е-АТ, а их антигенной мишени.

Библиографическая ссылка