Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Дубинина В.Г. 1 Носенко Е.Н. 1 Головатюк Е.П. 2 Макшаева Э.Т. 2 Пацкова А.И. 3 Косюга О.Н. 4

---

1 Одесский национальный медицинский университет

2 ООО «Медицинский центр репродуктивного здоровья «Гамета»

3 Университетская клиника «Центр восстановительной и реконструктивной медицины» Одесского национального медицинского университета

4 Коммунальное предприятие «Клиническая городская больница номер 1» г. Одессы

Целью исследования стало изучение особенностей кариотипа выкидышей от женщин с повторными самопроизвольными прерываниями беременностей, наступившими после проведения оплодотворения in vitro и естественного зачатия в зависимости от возраста. Проведены цитогенетические исследования 440 образцов ворсин хориона от супружеских пар с привычным невынашиванием беременности, среди которых 240 пар с беременностями, наступившими после проведения оплодотворения in vitro, и 200 пар с беременностями, наступившими при естественном зачатии. Установлено, что частота выкидышей с аномальным кариотипом после оплодотворения in vitro встречается реже по сравнению с таковыми при естественном зачатии в 1,44 раза. Аутосомные трисомии представляют наиболее распространенные хромосомные аномалии выкидышей как после оплодотворения in vitro, так и после естественного зачатия. Отличительными чертами выкидышей после оплодотворения in vitro по сравнению с такими после естественного зачатия являются большая частота аутосомных трисомий в 1,28 раза и меньшая встречаемость полиплоидий и структурных хромосомных аномалий соответственно в 3,43 и 4,14 раза. В группе женщин 35 лет и старше частота хромосомных аномалий выше таковой у пациенток до 35 лет при оплодотворении in vitro в 1,63 раза, а при естественном зачатии – в 1,23.

Статья в формате PDF

442 KB

ключевые слова: самопроизвольный аборт

оплодотворение in vitro

естественное зачатие

выкидыш

ворсины хориона

кариотип

хромосомные аномалии

цитогенетика

1. A comparative cytogenetic study of miscarriages after IVF and natural conception in women aged under and over 35 years / A. A. Pendina, O. A. Efimova, O. G. Chiryaeva [et al.] // J. Assist. Reprod Genet. – 2014. – Vol. 31, № 2. – Р.149-155. doi: 10.1007/s10815-013-0148-1.

2. Aneuploidy in Early Miscarriage and its Related Factors // Ch.-W. Jia, Li Wang, Y.-L. Lan [et al.] // Chin. Med. J. (Engl). – 2015. – Vol. 128, № 20. – P. 2772–2776. doi: 10.4103/0366-6999.167352.

3. Characteristics of chromosomal abnormalities diagnosed after spontaneous abortions in an infertile population / Werner M., Reh A., Grifo J. [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2012. – Vol. 29, № 8. – Р.817-820. doi: 10.1007/s10815-012-9781-3.

4. Chromosomal abnormalities in spontaneous abortion after assisted reproductive treatment / Kim J. W., Lee W. S., Yoon T. K. [et al.] // BMC Med. Genet. 2010. – Vol. 11 : 153. Published online 2010 November 3. doi: 10.1186/1471-2350-11-153.

5. Chromosomal analysis of couples with repeated spontaneous abortions in northeastern Іran / Ghazaey S., Keify F., Mirzaei F. [et al.] // Int. J. Fertil. Steril. – 2015. – Vol. 9, № 1. – Р.47-54.

6. Chromosome abnormalities identified in 457 spontaneous abortions and their histopathological findings / Yakut S.1., Toru H.S., Çetin Z. [et al.] // Turk. Patoloji Derg. – 2015. – Vol. 31, № 2. – Р.111-118. doi: 10.5146/tjpath.2015.01303.

7. Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial / Staessen C., Platteau P., Van Assche E. et al. // Hum. Reprod. – 2004. – Vol. 19, № 12. – P. 2849-2858.

8. Comparison of chromosomal abnormality rates in ICSI for non-male factor and spontaneous conception / Bingol B., Abike F., Gedikbasi A. [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2012. – Vol. 1. – Р.25–30. doi: 10.1007/s10815-011-9646-1.

9. Cytogenetic abnormalities in 1162 couples with recurrent miscarriages in southern region of India: report and review / Dutta U.R., Rajitha P., Pidugu V.K. [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2011. – Vol. 28, № 2. – Р.145-149.

10. Effects of increased paternal age on sperm quality, reproductive outcome and associated epigenetic risks to offspring / R. Sharma, A. Agarwal, V. K. Rohra [et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2015. – Vol. 13: 35. Published online 2015 April 19. doi: 10.1186/s12958-015-0028-x.

11. Kushnir V. A. Aneuploidy in abortuses following IVF and ICSI / V. A. Kushnir,, J. L. Frattarelli // J. Assist. Reprod. Genet. – 2009. – Vol. 26, № 2-3. – Р. 93-97.doi: 10.1007/s10815-009-9292-z.

12. Nagaoka So I. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem / So I. Nagaoka, T. J. Hassold, P. A. Hunt // Nat. Rev. Genet. – 2012. – Vol. 13, № 7. – P. 493–504. doi: 10.1038/nrg3245.

В первом триместре выкидыш является наиболее распространенным осложнением репродукции человека с частотой в диапазоне между 50 % до 70 % всех зачатий. Около 15 % клинически установленных беременностей приводят к спонтанному аборту в первом триместре [5]. Большинство клинически распознаваемых самопроизвольных прерываний беременности происходят между седьмой и одиннадцатой неделей беременности. Есть несколько основных этиологических факторов, которые могут быть связаны с потерями беременности: генетические, эндокринные, иммунологические, экологические, инфекционные [11].

В парах, которые страдают от повторяющихся самопроизвольных абортов, распространенность хромосомных аномалий варьирует от 2 до 8 % [9]. Клинические результаты дисбалансов кариотипа, как правило, смертельны для развития эмбриона, что приводит к повторяющимся самопроизвольным абортам или к ранней неонатальной смертности [9].

Особенно это касается женщин старше 35 лет, как при экстракорпоральном оплодотворении, так и при интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) [1]. Другие исследователи указывают на отсутствие повышенного риска хромосомных аномалий в связи оплодотворением in vitro за исключением большого числа половых хромосомных аномалий в группе ИКСИ с мужским бесплодием, то есть эти изменения могут быть связаны с родительскими аномалиями, а не с самой процедурой ИКСИ [3]. В исследованиях B. Bingol et al. (2012) [8], А.A. Pendina et al. (2014) [1] не было найдено никакой разницы в спектре аномалий кариотипа выкидышей между женщинами, которые зачали через оплодотворение in vitro, и теми, кто зачал естественно. Некоторые исследования показали повышенный риск выкидыша и числа анеуплоидий при увеличении возраста родителей [1, 10].

Целью исследования стало изучение особенностей кариотипа выкидышей от женщин с повторными самопроизвольными прерываниями беременностей, наступившими после проведения оплодотворения in vitro и естественного зачатия в зависимости от возраста.

Материал и методы

Проведено цитогенетические исследования 440 образцов ворсин хориона от супружеских пар с привычным невынашиванием беременности, среди которых 240 пар с беременностями, наступившими после проведения оплодотворения in vitro (группа I), и 200 пар с беременностями, наступившими при естественном зачатии (группа II). В зависимости от возраста в группах I и II выделены группы IА (n = 122) и IIА (n = 118), в которых возраст женщин был меньше 35 лет; группы IБ (n = 118) и II Б (n = 82), где возраст женщин был не менее 35 лет.

Диагноз привычного невынашивания беременности выставлялся на основании наличия у женщин из обследованных супружеских пар самопроизвольных абортов при беременностях, наступивших при естественном зачатии и / или в циклах оплодотворения in vitro. Биохимические беременности не учитывались.

Во избежание загрязнения материнской крови, образцы абортивного материала, содержащие ворсины хориона, промывали трижды в физиологическом растворе. Полученный препарат ворсин хориона (5–10 мг) помещали в чашку Петри диаметром 40 мм с раствором Хэнкса с гепарином (25000 ед. / 5 мл) и с пенициллином (50 МЕ) и стрептомицином (25 мг) на 500 мл среды (при +37 °С). Под контролем бинокулярной лупы отбирали ворсины и их фрагменты, отмывали от крови и помещали во флакон с гипотоническим раствором (5 мл) и колхицином (конечная концентрация – 2,5 мкг / мл). Гипотоническую обработку 0,9 % раствором цитрата натрия осуществляли при комнатной температуре или 35–40 мин. при +37 °С. При префиксации удаляли пипеткой 2–3 мл гипотонического раствора, добавляли по каплям такой же объем свежеприготовленного фиксатора (абсолютный метанол, ледяная уксусная кислота), встряхивая флакон, затем – струйно. Префиксацию проводили 45–90 мин. при комнатной температуре.

Для фиксации пипеткой удаляли весь префиксирующий раствор. Во флакон с ворсинками наливали 4–5 мл холодного фиксатора. Фиксацию проводили 1–2 часа при + 4 °С. В чистый пенициллиновый флакон наливали 3–4 мл свежего фиксатора, помещали в него ворсинку (2–3 мг) и добавляли равный объем дистиллированной воды. Через 2–5 мин., когда ворсинки опускались на дно, их извлекали пинцетом, высушивали на фильтровальной бумаге и переносили на чистое обезжиренное стекло, подогретое над пламенем спиртовки до + 40-50 °С, в каплю 60 %-ной уксусной кислоты. Мацерацию и выход клеток наблюдали с помощью инвертирующего микроскопа. Через 3–5 минут, покачивая стекло, добивались равномерного распределения суспензии на поверхности. Избыток суспензии с остатками исследуемого образца переносили на следующее предметное стекло. На препарат наносили 0,3–0,5 мл фиксатора, высушивали.

Окрашивание хромосом проводили стандартным GTG-методом. Препараты хромосом помещали в 0,25 % раствор трипсина на 10–30 с при комнатной температуре, затем трижды промывали в этиловом спирте с концентрацией 70 °, 96 ° и 100 °, с экспозицией не менее 30 с в каждом растворе. Полученные препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для окраски препаратов применяли 5 % раствор красителя Гимзы, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6,8). Процедура окрашивания продолжалась 4–5 мин. Затем препараты промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре.

Микроскопический анализ метафазных пластинок проводили при увеличении 1 000 с использованием микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss. Отбор метафазных пластинок и анализ хромосом осуществляли согласно общепринятым критериям [6].

Полученные данные статистически обрабатывали с помощью программы EXCEL.

Результаты и их обсуждение

Средний возраст пациентов групп I (33,98 ± 0,26 лет) и II (33,59 ± 0,29 лет), IА (30,94 ± 0,27 лет) и IIА (30,91 ± 0,26 лет), IБ (37,11 ± 0,21 лет) и IIБ (37,25 ± 0,37 лет) достоверно не отличался, что позволило в дальнейшем сравнивать полученные результаты.

Цитогенетический анализ продуктов зачатия показал, что 46,25 % (111/240) выкидышей после оплодотворения in vitro и 67,00 % (134/200) после естественного зачатия имели аномальный кариотип (p<0,01) (рис.). Таким образом, частота самопроизвольного прерывания беременности вследствие аномалий кариотипа при естественном зачатии была выше таковой при ИКСИ в 1,44 раза (ОШ=2,36±0,20, 95 % ДИ: 1,60–3,48). Известно, что аномалии кариотипа при потерях беременности возникают из-за ошибок в гаметогенезе, оплодотворении и дроблении [1, 3-5]. Поэтому полученные данные можно объяснить тем, что при искусственном оплодотворении выполняется отбор ооцитов, сперматозоидов, эмбрионов и проводится предимплантационная генетическая диагностика. Ряд сравнительных исследований подтвердил, что исключение при оплодотворении in vitro анеуплоидных эмбрионов для переноса может улучшить имплантацию, снизить уровень самопроизвольных абортов и избежать рождения детей с числовыми хромосомными аномалиями после искусственного оплодотворения [7].

Анализ по возрастным группам показал, что в группе женщин 35 лет и старше частота хромосомных аномалий была выше таковой у лиц до 35 лет при оплодотворении in vitro в 1,63 раза (57,63 % (68/118) против 35,25 % (43/122), p<0,01; ОШ=2,50±0,27; 95% ДИ: 1,48-4,21), а при естественном зачатии достоверно не отличалась (75,61 % (62/82) против 61,02 % (72/118), p>0,05). Среди пациенток моложе 35 лет хромосомные аномалии при естественном зачатии встречались в 1,74 раза чаще, чем при оплодотворении in vitro (61,02 % (72/118) против 35,25 % (43/122), p<0,01; ОШ=2,88±0,27; 95 % ДИ: 1,70-4,86), а среди лиц 35 лет и старше – в 1,31 (75,61 % (62/82) против 57,63 % (68/118); p<0,03; ОШ=2,28±0,32; 95 % ДИ: 1,22–4,25).

По данным литературы, влияние возраста матери на кариотип плода обусловливается следующими факторами: различные повреждающие моменты, скрыто увеличивающие частоту хромосомных аномалий в плодном яйце; события, происходящие в гонадах плода, влияющие на профазные взаимодействия между гомологичными хромосомами; длительная остановка профазы у женщин, способствующая анеуплоидии из-за возрастного распада компонентов мейотического механизма; экологические факторы, воздействующие на нескольких различных стадиях оогенеза и благоприятствующие формированию аномалий кариотипа [12].

А

Б

В

Цитогенетические исследования ворсин хориона: А – моносомия по Х хромосоме; Б – трисомия по хромосоме 13; В – трисомия по хромосоме 21

Среди выявленных аномальных кариотипов аутосомные трисомии составили среди выкидышей после оплодотворения in vitro 75,68 % (84/111) и после естественного зачатия –58,96 % (79/134) (p<0,01; ОШ=2,17±0,28; 95% ДИ: 1,25-3,77); множественные трисомии – соответственно 6,31 % (7/111) и 4,48 % (6/134) (p>0,05); дисомии Х – 2,70 % (3/111) и 0,75% (1/134) (p>0,05); моносомии Х – 4,50 % (5/111) и 4,48 % (6/134) (p>0,05); моносомии 21 – 1,80 % (2/111) и 0,75 % (1/134) (p>0,05); полиплоидии – 6,31 % (7/111) и 21,64 % (29/134) (p<0,01; ОШ=4,10±0,44; 95% ДИ: 0,41,72-9,78); структурные хромосомные аномалии – 1,80 % (2/111) и 7,46 % (10/134) (p<0,05; ОШ=4,40±0,79; 95% ДИ: 0,94-21,50); маркерная хромосома – 0,90 % (1/111) и 1,49 % (2/134) (p>0,05). Таким образом, достоверными цитогенетическими особенностями выкидышей после оплодотворения in vitro по сравнению с такими после естественного зачатия были: большая частота аутосомных трисомий в 1,28 раза и меньшая встречаемость полиплоидий и структурных хромосомных аномалий соответственно в 3,43 и 4,14 раза.

Статистически достоверной разницы в распределении частот аномальных кариотипов среди выкидышей от женщин моложе и старше 35 лет как после оплодотворения in vitro, так и после естественного зачатия не выявлено, что совпадает с данными [2]. Зарегистрированы некоторые особенности частоты встречаемости трисомий в зависимости от возраста: среди исследуемых пациенток с выкидышами после оплодотворения у женщин до 35 лет наиболее часто встречались по мере убывания трисомия 13, 22, 15 и множественные трисомии, а у женщин 35 лет и старше – трисомия 16, 15, 22, 21; среди испытуемых с выкидышами после естественного зачатия у женщин до 35 лет наиболее частыми трисомиями по мере убывания были: трисомия 16, 13, 18 и 21, а у женщин 35 лет и старше – 16, 22, 15, 13 и 18.

Выводы

Частота выкидышей после оплодотворения in vitro с аномальным кариотипом встречается реже по сравнению с таковыми при естественном зачатии в 1,44 раза. Аутосомные трисомии представляют наиболее распространенные хромосомные аномалии выкидышей как после оплодотворения in vitro, так и после естественного зачатия. Отличительными чертами выкидышей после оплодотворения in vitro по сравнению с такими после естественного зачатия являются большая частота аутосомных трисомий в 1,28 раза и меньшая встречаемость полиплоидий и структурных хромосомных аномалий соответственно в 3,43 и 4,14 раза. В группе женщин 35 лет и старше частота хромосомных аномалий выше таковой у пациенток до 35 лет при оплодотворении in vitro в 1,63 раза, а при естественном зачатии достоверно не отличается.

Библиографическая ссылка