Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ПОДВИЖНОСТЬ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В СОСТАВЕ ВТОРИЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР

Кубасова А.Н. 1 Манжесов В.И. 1 Галочкина Н.А. 1 Глотова И.А. 1
1 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I»
Перспективными объектами растительного происхождения с высоким биотехнологическим потенциалом в области получения белковых продуктов и обогащения пищи минорными компонентами являются продукты промышленной переработки масличных культур – жмых и шрот рапса и подсолнечника. Среди белков подсолнечника преобладает щелочерастворимая фракция с низкой растворимостью в технологических средах, характерных для пищевой промышленности. Среди белков рапса преобладает водорастворимая фракция, однако суммарное содержание глютелинов и нерастворимых фракций в нативном жмыхе превосходит исходное содержание водорастворимых белков, Это обусловливает целесообразность получения биомодифицированных белковых препаратов, в том числе в связи с комплексным составом субстратов (белковые фракции находятся в комплексе с углеводными фракциями). Проведен скрининг ферментных препаратов отечественного и зарубежного производства по уровню преобладающей биохимической активности и физико-химическим характеристикам с прогнозируемым эффектом целенаправленной биотрансформации белково-углеводных субстратов. Исследовано влияние ферментативной обработки на распределение электрофоретических фракций модифицированных белковых фракций жмыха рапса и подсолнечника. Установлено изменение количества белковых фракций, различающихся электрофоретической подвижностью в условиях неденатурирующего электрофореза в ПААГ. Путем электрофоретического исследования структурных особенностей продуктов биомодификации белков в составе жмыха рапса и подсолнечника установлено соответствие направления биотрансформации нативных биополимеров поставленной цели в случае использования комплексного препарата Целлолюкс-А, который обладает комплексной активностью в отношении углеводных и белковых субстратов.
рапс
продукты переработки
жмых
белок
биомодификация
ферментные препараты
электрофорез.
1. Антипова Л. В., Глотова И. А., Астанина В. Ю. Способ получения концентрата белков из растительного сырья // Патент России № 2174757.2000. Бюл. № 29.
2. Антипова Л. В., Глотова И. А., Жаринов А. И. Методы исследования мяса и мясных продуктов. – Воронеж, 2000.
3. Белова Е. И. Биотехнология комплексной переработки рапсового жмыха / Е. И. Белова, А. Н. Кубасова// Технологии и товароведение сельскохозяйственной продукции. – 2013. – № 1. – С. 68-72.
4. Королькова Н. В., Калашникова С. В. Изменение содержания белка при хранении семян рапса в различных газовых средах // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. – 2007. – № 1. – С. 13-14.
5. Королькова Н. В., Котик О. А., Трухман С. В. Исследование процесса рафинации рапсового масла // Вестник Воронежского государственного аграрного университета. – 2007. – № 15. – С. 127-129.
6. Королькова Н. В., Котик О. А., Калашникова С. В. Биохимический состав семян рапса при хранении в различных газовых средах // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. – 2002. – № 5–6. – С. 11-13.
7. Манжесов В. И., Кубасова А. Н., Курчаева Е. Е., Сысоева М. Г., Глотова И. А. Экзогенный биокатализ в решении проблемы рационального использования жмыха рапса // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 2;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24227 (дата обращения: 01.04.2016).
8. Рензяева Т. В. Функциональные свойства белковых продуктов из жмыхов рапса и рыжика/ Т. В. Рензяева // Техника и технология пищевых производств. – 2009. – № 4.
9. Федотов В. А., Гончаров С. В., Савенков В. П. Рапс России. – М.: Агролига России, 2008. – 336 с.
10. Davis B. J. Disc electrophoresis II. Method and aplication to human serum protein / B. J. Davis // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1994. – Vol. 121. – P. 404-427.

Как объект агробиотехнологии рапс имеет большое значение в качестве источника продовольствия, традиционно в виде рапсового масла [5-6], а также выступает источником производства кормовой продукции на основе рапсового жмыха. В структуре производства и переработки продукции растениеводства рапс позиционируется как культура, имеющая большое продовольственное, кормовое, техническое, агротехническое и экологическое значение. Он является одной из важнейших масличных и кормовых культур. Расширение его посевных площадей имеет широкие перспективы в России, прежде всего для производства растительного масла, а также как источник биотоплива [9].

Рапсовые жмых и шрот – хорошие источники минеральных веществ, богаты жиро- и водорастворимыми витаминами: токоферолом, ретинолом, рибофлавином, холином, биотином, а по содержанию кальция, фосфора, магния, меди и марганца превосходят соевые [9]. Хорошо сбалансированный по незаменимым аминокислотам, и особенно по серусодержащим [4], белок рапса весьма интересует специалистов в области питания. Однако потенциальные возможности жмыхов масличных культур как источников пищевых белковых веществ, в том числе эссенциальных компонентов питания, реализованы крайне недостаточно [1, 3].

SWOT-анализ жмыхов масличных культур является эффективным инструментом в обосновании биотехнологических подходов к их использованию в качестве источников пищи и кормов. До недавнего времени использование жмыха рапса ограничивалось в связи с наличием в семенах рапса и продуктах его переработки антипитатальных веществ. Важнейшие из них – тиогликозиды, предшественники соединений, вызывающих нежелательный вкус или приводящих к расстройству функции щитовидной железы. В настоящее время эта проблема решается выведением новых селекционных сортов и гибридов рапса с низким содержанием антипитательных веществ (сорта рапса типа «00» содержат эруковую кислоту в количестве не более 5 % от суммы жирных кислот и гликозинолаты – не выше 3 % от массы семян), что позволяет рассматривать его семена как весьма перспективный источник растительного масла, а жмых и шрот – как дополнительные источники пищевого белка.

Цель работы – обоснование подходов к реализации эффективных экологически чистых биотехнологических способов получения отечественных растительных белковых препаратов, перспективными, дешевыми и доступными источниками получения которых являются продукты переработки масличных культур, в том числе рапса и подсолнечника.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили: жмых, полученный методом прессования от низкоэрукового сорта рапса «Гонар» урожая 2013 г. (производитель – ЗАО «Алые поля» Воронежской обл.), ферментные препараты отечественного и импортного производства, характеристика которых, по данным производителей, представлена в работе [7], а также продукты биомодификации биополимерных систем жмыха рапса с их использованием.

Cущественный интерес представляет изучение условий применения в реализации поставленной цели следующих ферментных препаратов.

1) Препарат протеолитического действия животного происхождения − коллагеназа, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtshatica (производитель – ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково, Московской области). рН-оптимум 7,5-7,75, протеолитическая активность 100 ед/г. Температурный оптимум 37-45 °С.

2) Препарат протеолитического действия бактериального происхождения − GC-401 (производитель – «Дженикор интернешенел», США). Продуцент Aspergilus niger, рН-оптимум 5,5–6,6, протеолитическая активность 600 ед./см3. Температурный оптимум 55–65 °С.

Производителем следующих ферментных препаратов является ООО ПО «Сиббиофарм» (Россия, Новосибирская обл., г. Бердск).

3) Препарат Амилолюкс А., который имеет грибное происхождение. Продуцент – Aspergillus avamori, рН-оптимум 5,0-7,0, протеолитическая активность 1500 ед./см3. Температурный оптимум 50–70 °С.

Основной фермент амилолитических препаратов – α-амилаза – гидролизует внутренние α-1,4-гликозидные связи крахмала. Комплекс сопутствующих ферментов (ксиланаза, β-глюканаза, целлюлаза, протеаза) позволяет освободить крахмал из эндосперма и разрушить глюкопротеиновые связи.

4) Препарат протеолитического действия бактериального происхождения – Протосубтилин Г3х. Продуцент Bacillus subtilis, рН-оптимум 6,0–7,0, протеолитическая активность 70 ед./см3, плотность 1,05 г/см3 . Температурный оптимум 45–50 °С.

Протосубтилин Г3х катализирует расщепление растительных белков, т.е. обеспечивает разрыв связи – CO - NH – с образованием пептидов низкой молекулярной массы и аминокислот. Еще одной функцией Протосубтилина Г3х является разрушение углеводно-протеиновых связей, что позволяет повысить степень очистки белковых фракций до категории изолятов.

Нейтральные протеазы являются одними из наиболее активных протеолитических ферментов. Щелочные протеазы гидролизуют не только внутренние, но и терминальные пептидные связи. Комплекс протеаз гидролизует высокомолекулярные растительные белки до пептидов и аминокислот, однако, в данном случае, повышение степени гидролиза белка сопряжено с дополнительными потерями в виде водорастворимых фракций.

5) ЦеллоЛюкс-А – комплексный ферментный препарат грибного происхождения. Протеолитическая активность 2000 ед./см3, температурный оптимум 50–60 °С, рН-оптимум 4,0–6,0. Проявляет активность в отношении углеводных субстратов. По рекомендациям производителя ООО ПО «Сиббиофарм», применение комплекса ферментов в составе препарата Целлолюкс-А позволяет: повысить эффективность использования сырья за счет более глубокого гидролиза; стабилизировать технологический процесс; повысить качество готовой продукции; обеспечить безопасную эксплуатацию оборудования; повысить культуру производства.

Идентификацию структурных особенностей продуктов биомодификации белков в составе жмыхов рапса и подсолнечника проводили по методу Davis [10]. Разделяющий гель содержал Трис-HCI, рН 8,3, ТЕМЕД, акриламидную смесь (30 % ACA / 0,8 % MBA), персульфат аммония. Концентрирующий гель содержал Tрис-HCI рН 6,7, ТЕМЕД, акриламидную смесь (10% ACA / 2,5% MBA). Концентрация концентрирующего геля составляла 4 %, а разделяющего – 8 %.

Идентификацию белковых фракций проводили нитратом серебра по следующей методике. 1. Фиксация. Гель помещали в раствор, содержащий 50 % ацетона, 1,5 % ТХУ, 0,2 % формальдегида. Отмывали водой 5–10 мин. 2. Гель помещали в 50 %-ный ацетон на 5–10 мин. После этого отмывали несколькими порциями воды. 3. На следующем этапе пластинку геля инкубировали в 0,02 % растворе тиосульфата натрия в течение 1 мин, после чего отмывали водой в течение 5 мин. 4. На следующей стадии идентификации белковых фракций гель помещали на 8 мин в раствор, содержащий 0,2 % нитрата серебра и 0,1 % формальдегида, после чего отмывали водой 3–5 раз по 2 мин. 5. Проявление геля проводили в растворе, содержащем 0,7 % бикарбоната натрия, 0,01 % формальдегида. Окраску геля осуществляли до появления полос, после чего помещали его в 7 % уксусную кислоту.

Электродный буфер представлял собой смесь 0,5 М Tрис-глицинового буфера рН 8,3. Напряжение электрического тока подбирали из расчета 5 мА на один слот.

Результаты исследований и их обсуждение

В результате исследований получены электрофореграммы, общий вид которых на примере белковых фракций жмыха рапса представлен на рисунке.

Электрофореграммы белковых фракций жмыха рапса: 1 – без ферментного препарата; после биомодификации с использованием ферментных препаратов: 2 – коллагеназа;

3 – GS-401; 4 – Амилолюкс А; 5 – Целлолюкс А; 6 – протосубтилин ГЗх

Для определения относительной электрофоретической подвижности и количества белковых фракций в результате действия комплексных ферментных препаратов на жмых рапса был проведен неденатурирующий электрофорез в ПААГ, результаты которого представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Результаты неденатурирующего электрофореза в ПААГ белков жмыха рапса

Ферментный препарат

Количество полос

Относительная электрофоретическая подвижность (Rf), отн. Ед.

Интенсивность

окраски, %

Без ферментного

препарата

3

0,029

50

0,155

30

0,223

20

Коллагеназа

2

0,174

50

0,34

50

GS-401

6

0,029

25

0,107

30

0,175

20

0,233

15

0,359

7

0,534

3

Амилолюкс А

4

0,058

50

0,204

30

0,427

10

0,485

10

Целлолюкс А

3

0,039

70

0,204

20

0,427

10

Протосубтилин ГЗх

4

0,049

30

0,136

20

0,243

25

0,33

25

 

Таблица 2

Результаты неденатурирующего электрофореза в ПААГ белков жмыха подсолнечника

Ферментный препарат

Количество полос

Относительная электрофоретическая подвижность (Rf), отн. ед.

Интенсивность

окраски, %

Без фермента

4

0,025

40

0,132

30

0,157

20

 

0,212

10

Коллагеназа

3

0,176

35

0,218

33

 

0,36

32

GS-401

9

0,025

20

0,076

30

0,158

18

0,240

15

0,285

12

0,298

7

 

0,370

6

 

0,420

4

 

0,480

3

Амилолюкс А

5

0,05

30

0,202

25

0,360

25

0,420

10

 

0,460

10

Целлолюкс А

4

0,035

60

0,210

20

0,360

10

 

0,420

10

Протосубтилин ГЗХ

5

0,045

25

0,148

20

0,245

20

0,285

20

 

0,354

15

В результате анализа полученных электрофореграмм и данных об использованных ферментных комплексах можно сделать следующие выводы по отношению к белковым фракциям рапса.

1. Пробы, обработанные коллагеназой, характеризуются наименьшим количеством полос.

2. Эффективный протеолиз под действием GS-401 привел к появлению 6 фрагментов белков в случае жмыха рапса. Анализ полученных электрофореграмм позволяет предположить, что часть белковых фрагментов имеет небольшую молекулярную массу, так как нами были обнаружены белковые полосы, Rf которых приближается к 0,3–0,5

3. Использование препарата Амилолюкс А привело к появлению четырех фрагментов белков по сравнению с контролем. Кроме того, весьма интересен факт, что по Rf имеются совпадающие белковые зоны между Амилолюкс А и Целлолюкс А. Белковые фрагменты, полученные в результате воздействия ферментного комплекса Амилолюкс А, имеют более высокую электрофоретическую подвижность, что обусловлено, видимо, удалением из белковой глобулы крахмальных компонентов (под действием α-амилаз).

4. После применения препарата Целллолюкс А электрофоретический анализ показал наличие трех белковых зон с Rf 0,039; 0,204; 0,427 соответственно.

Удаление целлюлозы из углевод-протеинового комплекса увеличило значение Rf у всех белков. Особое внимание следует обратить на третью белковую зону, в которой Rf увеличивается в 2 раза, что обусловлено интенсивным протеолитическим действием препарата.

5. Применение препарата Протосубтилин Г3х, являющегося комплексным ферментным препаратом бактериального происхождения, приводит к появлению большого количества пептидов в пробе.

Таким образом, в результате визуального анализа электрофореграммы можно заключить, что наибольшее интенсивное протеолитическое действие на белковые фракции рапса оказывает препарат GS-401, однако малое количество полос при обработке коллагеназой и другими препаратами может быть связано с более глубоким гидролизом пептидов из пробы до низкомолекулярных фрагментов, которые не идентифицируются при данных условиях проведения электрофореза.

Результаты показывают, что количество полос на электрофореграммах подсолнечника во всех случаях превосходит этот показатель для белков рапса. Среди белков подсолнечника преобладает щелочерастворимая фракция с низкой растворимостью в технологических средах, характерных для пищевой промышленности. Среди белков рапса преобладает водорастворимая фракция, однако суммарное содержание глютелинов и нерастворимых фракций в нативном жмыхе превосходит исходное содержание водорастворимых белков, обусловливая в качестве задачи работы получение биомодифицированных белковых препаратов, в том числе, в связи с комплексным составом субстратов (белковые фракции находятся в комплексе с углеводными фракциями). Использование комплексных ферментных препаратов целесообразно для повышения степени экстрагирования белковых фракций из жмыха рапса и подсолнечника и последующего обеспечения их функциональности в пищевых системах [2, 8].

Выводы

Установлено изменение количества белковых фракций, различающихся электрофоретической подвижностью в условиях неденатурирующего электрофореза в ПААГ и растворимостью в воде, солевых и щелочных модельных технологических средах. Путем электрофоретического исследования структурных особенностей продуктов биомодификации белков в составе жмыха рапса и подсолнечника установлено соответствие направления биотранс-формации нативных биополимеров поставленной цели в случае использования комплексного препарата Целлолюкс-А, который обладает комплексной активностью в отношении углеводных и белковых субстратов.


Библиографическая ссылка

Кубасова А.Н., Манжесов В.И., Галочкина Н.А., Глотова И.А. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ПОДВИЖНОСТЬ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В СОСТАВЕ ВТОРИЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 2. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=24317 (дата обращения: 06.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074