Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ПРОТЕАЗЫ И ИХ СЫВОРОТОЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ У ОВАРИЭКТОМИРОВАНННЫХ САМОК КРЫС WISTAR ПРИ РАЗВИТИИ ОСТЕОПОРОЗА

Воропаева А.А. 1 Фаламеева О.В. 1 Садовой М.А. 1 Щелкунова Е.И. 1 Русова Т.В. 2
1 ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России
2 ФГБУ ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна Минздрава России
Изучена активность катепсина К, матриксных металлопротеаз, активность α2-макроглобулина и α1-антитрипсина, а также и концентрация ММП-2 в сыворотке крови у овариэктомированных самок крыс Wistar на фоне снижения минеральной плотности скелета. Показано, что овариэктомия приводит к увеличению активности катепсина К и общей активности ММП, а также концентрации ММП-2 в сыворотке крови у крыс Wistar. При этом не изменяется активность сывороточных ингибиторов широкого спектра протеаз α2-макроглобулина и α1-антитрипсина. Снижение минеральной плотности скелета у овариэктомированных крыс не влияет на концентрацию кальция и фосфора в сыворотке крови, однако отражается на активности щелочной и тартрат-резистентной кислотой фосфатазы в сыворотке крови. Снижение активности щелочной фосфатазы говорит о снижении формирования костного матрикса. Снижение активности тартрат-резистентной кислотой фосфатазы на фоне увеличения концентрации ММП-2 в сыворотке крови овариэктомированных крыс косвенно может свидетельствовать о том, что резорбция костной ткани в этом случае осуществляется меньшим количеством более активных остеокластов.
матриксные металлопротеазы
овариэктомированные крысы
ремоделирование костной ткани
остеопороз
катепсин К
щелочная фосфатаза
тартрат-резистентная кислая фосфатаза
1. Активность катепсина К и матриксных металлопротеаз в костной ткани у крыс OXYS при развитии остеопороза / Венедиктова А.А., Фаламеева О.В., Колосова Н.Г. и др.// Биомедицинская химия – 2010 – Т.56, №2 – С.274-282.
2. Беневоленская Л.И. Руководство по остеопорозу. М.: 2003. 524 с.
3. Венедиктова А.А. Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс: автореферат дис. канд. биол. наук. – Новосибирск, 2009. – 24 с.
4. Гликозаминогликаны костного матрикса при развитии остеопороза у преждевременно стареющих крыс OXYS / Ершов К.И., Русова Т.В., Садовой М.А. и др.// Успехи геронтологии – 2009 – Т.22, №2. – С.285-291.
5. Камышников В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: в 2 Т. Т1. – 2-е изд. – Мн.: Беларусь, 2002. 495 с.
6. Универсальный регулятор – α2-макроглобулина (обзор литературы) / Зорин Н.А., Зорина В.Н., Зорина Р.М., Левченко В.Г. // Клиническая лабораторная диагностика – 2004. – №11 – С.18.
7. Ярыгина Е.С. Клинико-диагностическое значение активности матриксных металлопротеаз и лизосомальных ферментов при артритах у детей: дис. канд. мед. наук. – Новосибирск, 2005.
8. Pivotal role of cathepsin K in lung fibrosis /Buhlung F., Rocken C., Brasch F. et al. // Am. J. Pathol. – 2004. – Vol. 164. – P. 2203 – 2216.
9. Functional heterogeneity of osteoclasts: matrix metalloproteinases participate in osteoclastic resorption of calvarial bone but not in resorption of long bone. /Everts V., Korper W., Jansen D.C. et al. // FASEB J. – 1999 – Vol.13. – P. 1219 – 1230.
10. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b) as a marker of bone resorption Halleen J. Tiitinen S.L., Ylipahkala H. et al. // Rev. Series. – 2006. – Vol. 3. – P. 1- 9.

Остеопороз - системное заболевание скелета, сопровождающееся изменением микроархетиктоники, состава и как следствие - уменьшением прочности костной ткани [4].

Основную массу больных остепорозом составляют лица женского пола, что зачастую связано с дисфункцией гонад [1]. В основе патогенеза данного заболевания лежит нарушение ремоделирования матрикса костной ткани, в норме представляющего сбалансированный процесс резорбции костной ткани остеокластами и биосинтеза компонентов матрикса костной ткани остеобластами [2, 3].

Резорбция костной ткани сопровождается высвобождением кальция, фосфора и тартрат-резистентной кислой фосфатазы (ТРКФ), в сыворотку крови. Эти показатели до сих пор используются для оценки состояния процессов резорбции костной ткани как показатели деятельности остеокластов, а активность ЩФ - как показатель активности остеобластов [5]. Эти простые и недорогие методы диагностики обладают рядом недостатков, главными из которых являются невысокая информативность, низкая специфичность, а также существующие противоречивые данные об их изменении при нарушении резорбции костной ткани [3].

При резорбции костной ткани после растворения гидроксиапатитов происходит расщепление органических компонентов костного матрикса с участием протеолитических ферментов остеокластов. Ключевая роль в этом процессе принадлежит цистеиновой протеазе катепсину К [8]. Предполагают, что он вовлечен в развитие остеопороза различного генеза, в том числе - сенильного и развивающегося у женщин в постменопаузальном периоде [8]. Также показано участие матриксных металлопротеаз (ММП) первого, второго, седьмого, девятого, тринадцатого типа в ремоделировании костной ткани, однако сведения об их участии в резорбции кости противоречивы. К настоящему времени не изучена степень вовлеченности катепсина К и ММП в патогенез разных вариантов остеопороза и не определена возможность использования сывороточной активности катепсина К и ММП в качестве прогностических маркеров.

Логично предположить, что заболевание, связанное с усилением активности протеаз может смещать баланс протеазы/ингибиторы в организме в сторону протеаз за счет выхода протеаз в кровяное русло. Изменение этого баланса создают условия для развития многих патологий [3, 7] и могут усугублять течение основного заболевания. Контроль за активностью протеаз, попавших в кровоток из различных органов и тканей осуществляется α2-макроглобулином и α1-антитрипсином. А2-макроглобулин обладает свойством захватывать и ингибировать все известные классы пептидаз. Комплексы α2-макроглобулина с протеазами элиминируются из крови в течение 2 минут [6] поэтому активность α2-макроглобулина в сыворотке отражает ее ингибиторные возможности. Кроме того, α2-МГ осуществляет транспорт различных цитокинов, в том числе - трансформирующего фактора роста β, стимулирующего остеобласты и подавляющего активность остеокластов. Однако, после связывания с протеазами, комплексы цитокин-ингибитор-протеаза опознаются макрофагами печени как элементы, подлежащие деградации, поэтому происходит их захват и расщепление. Таким образом, цитокины могут не достигать клеток-мишеней [9].

Изменения активности α2-макроглобулина и α1-антитрипсина как резервов, способствующих адаптации организма при усилении резорбции костной ткани, а также возможность частичной передачи функций инактивации протеаз от одного ингибитора другому при усилении резорбции костного матрикса не изучались.

В соответствии с изложенным выше, целью работы явилось исследование активности протеаз, принимающих участие в ремоделировании костной ткани и сывороточных ингибиторов у овариэктомированных самок крыс.

Материалы и методы

Работа выполнена на 20-ти самках крыс Wistar. Десяти из них по достижению половозрелости, в возрасте 3 месяца, была проведена овариэктомия, 10 животных послужили контролем и поэтому оставались интактными. По прошествии 5 месяцев с овариэктомии, в момент регистрации снижения минеральной плотности костной ткани  на остеоденситометре HOLOGIC (QDR, Discovery-A, США) у овариэктомированных крыс, обе группы животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом.

Активность катепсина К  и ММП определяли в соответствие с  [1], используя флуоресцентный субстрат Z-Gly-Pro-Arg-MCA (Sigma, США) и МСА-Pro-Leu-Gly-Leu-DpA-Ala-Arg-NH2 (American Peptide Co, США) соответственно. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд.

Сыворотку крови получали центрифугированием при 900 g в течение 20 минут. Общую концентрацию ММП-2 в сыворотке крови определяли с помощью набора R&D (США) для иммуно-ферментного анализа в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию кальция, фосфора, активность ЩФ, и ТРКФ в сыворотке крови определяли колориметрическим методом с использованием наборов «Вектор-Бест» (Россия) в соответствии с протоколами производителя. Активность α2-макроглобулина и α1-антитрипсина определяли против бензоил-аргинин-этилового эфира, используемого в качестве субстрата, по методу Яровой в модификации [7].

Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для корреляционного анализа применен критерий Спирмена. Результаты считали статистически достоверными при р<0.05.

Результаты и обсуждение

Через 5 месяцев после овариэктомии у крыс было зарегистрировано снижение общей минеральной плотности скелета относительно контрольной группы (Табл. 1).

Таблица 1

Показатели ремоделирования у самок крыс Wistar в сыворотке крови

Изучаемый параметр

Контрольные крысы

Овариэктоми-рованные крысы

Минеральная плотность скелета, г/см2

0,154±0,005

0,139±0,005*

Активность катепсина К, нмоль/мин на 1мл

0,87±0,18

1,25±0,13*

Общая активность ММП, мкМ/мин на 1 мл

2,47±1,35

4,56±0,99***

Концентрация ММП-2, нг/мл

92,00±2,75

140,00±8,02**

Активность α2-макроглобулина, мкмоль/мин на 1 мл

4,11±0,23

3,87±0,15

Активность α1-антитрипсина, мкмоль/мин на 1 мл

32,59±3,24

33,10±1,79

Активность ТРКФ, мкМ/мин на 1 л

11,01±0,98

8,74±1,01**

Активность ЩФ, мкМ/мин на 1 мл

276,37±42,65

191,98±26,00*

Концентрация кальция, мМ/л

2,33±0,10

2,26±0,13

Концентрация фосфора, мМ/л

2,30±0,21

1,96±0,10

Данные представлены как M±m, *p < 0,05, **p < 0,01, по сравнению c группой контроля

Определение активности протеаз в сыворотке крови показало, что у овариэктомированных крыс по сравнению с группой контроля увеличивается активность протеазы, ответственной за резорбцию в наибольшей степени - активность катепсина К и общая активность ММП, а также концентрация ММП-2 (Табл. 1).

При этом активность сывороточных ингибиторов протеаз α2-макроглобулина и α1-антитрипсина у овариэктомированных крыс оставались на уровне крыс контрольной группы. Это свидетельствует о том, что общая протеазная нагрузка у овариэктомированных животных в эти сроки после овариэктомии не является избыточной настолько, чтобы стать сигналом к усилению экспрессии этих ингибиторов как это происходило в случае идиопатического остеопороза у преждевременно стареющих крыс OXYS [1] и, соответственно, - к увеличению их активности, а также не является острой, иначе бы наблюдалось снижение их активности в сыворотке. Возможно также, что активность катепсина К у овариэктомированных крыс в значительной степени подавляется цистатинами - специфичными ингибиторами цистеиновых протеаз, а активность ММП - тканевыми ингибиторами металлопротеаз до того, как они выйдут в кровяное русло.

Несмотря на усиление резорбции костной ткани у овариэктомированных крыс, концентрация кальция у животных всех трех групп была на одном уровне (Табл. 1), что свидетельствует о способности организма овариэктомированных животных поддерживать концентрацию кальция в пределах нормы за счет кальций-регулирующих гормонов.

Активность ЩФ и ТРКФ в сыворотке крови у животных после овариэктомии снижалась, что говорит о нарушении ремоделирования костной ткани, но судить о том, что при этом преобладает резорбция можно только по увеличению активности катепсина К и ММП в сыворотке крови. Снижение активности ЩФ в сыворотке крови овариэктомированных крыс свидетельствует о снижении формирования костного матрикса.

В контрольной группе крыс выявлена положительная корреляция между общей концентрацией ММП-2 и активностью ТРКФ в сыворотке крови (r=0.90, р<0.01), что может свидетельствовать о принадлежности остеокластам значительной доли ММП-2 определяемой в сыворотке у самок контрольной группы. У овариэктомированных самок обнаружена отрицательная корреляционная связь между сывороточной активностью ММП и ТРКФ (r=-0.54, р<0.05). Поскольку ТРКФ является маркером количества остеокластов [10], то можно предположить, что резорбция костной ткани у контрольных животных происходит за счет большего количества умеренно активных остеокластов, в то время как у овариэктомированных, судя по сниженной активности ТРКФ и повышенной концентрации ММП-2 в сыворотке крови, резорбция осуществляется меньшим количеством более активных остеокластов.

Заключение

Таким образом, показано, что овариэктомия существенно изменяет вовлеченность ММП в ремоделирование скелета. Полученные данные позволяют предполагать, что одним из механизмов его действия на ремоделирование костной ткани может являться снижение экспрессии металлопротеаз в остеокластах, отличных от ММП-2, таких, как, например, ММП-9, которая принимает значительное участие в резорбции [9].

Активность катепсина К в сыворотке крови может служить маркером резорбции костной ткани при остеопорозе, вызываемом дисфункцией гонад.


Библиографическая ссылка

Воропаева А.А., Фаламеева О.В., Садовой М.А., Щелкунова Е.И., Русова Т.В. ПРОТЕАЗЫ И ИХ СЫВОРОТОЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ У ОВАРИЭКТОМИРОВАНННЫХ САМОК КРЫС WISTAR ПРИ РАЗВИТИИ ОСТЕОПОРОЗА // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=23768 (дата обращения: 28.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074