Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

РАЗМНОЖЕНИЕ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO LILIUM CERNUUM KOM., LILIUM DISTICHUM NAKAI. И LILIUM PUMILUM DELILE ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭКСПЛАНТОВ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ЦВЕТКА

Набиева А.Ю. 1
1 Центральный сибирский ботанический сад
Статья посвящена актуальной проблеме сохранения редких видов растений азиатской части России. Показана возможность массового получения растений-регенерантов и их сохранения с помощью метода культуры ткани при использовании в качестве эксплантов фрагментов неокрашенных цветков 3 редких видов лилий азиатской части России. Проведенный гистологический анализ позволил выделить 3 варианта развития морфогенетической реакции у эксплантов лилий в зависимости от минерального состава среды и регуляторов роста растений. В статье рассмотрены преимущества использования тканей и органов цветка в качестве эксплантов для введения в культуру in vitro трех редких видов лилий азиатской части России с целью сохранения и последующего массового размножения данных видов. Изучены пути реализации морфогенетической реакции трех различных типов эксплантов в зависимости от минерального состава питательной среды и регуляторов роста. С помощью гистологического анализа ранних этапов пролиферации тканей и органов цветка подтверждена возможность получения растений - регенерантов всех трех видов лилий путем адвентивного органогенеза, тогда как соматический эмбриогенез был отмечен у L. pumilum и L. cernuum. Процесс образования микролуковичек у всех изученных видов лилий происходил более интенсивно на вариантах среды N6m, чем на средах MSm-1 и MSm-2. Применение холодовой обработки полученных микролуковиц позволило успешно провести адаптацию растений-регенерантов в почвенной культуре.
морфогенез
экспланты цветка
редкие виды лилий
культура in vitro
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. – М.: ФБК–ПРЕСС, 1999. – 160 с.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры ткани в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наукова думка, 1980. – 488 с.
3. Растения Красной книги России в коллекциях ботанических садов и дендрариев/ РАН. Отд-ние. биол. наук. Совет ботан. садов России. Глав. ботан. сад им. Н. В. Цицина. – М., 2005. – 142 с.
4. Azadi P., Khosh-Khui M. Micropropagation of Lilium ledebourii (Baker) Boiss as affected by plant growth regulator, sucrose concentration, harvesting season and cold treatments// Electron. J. Biotechn. – 2007. – Vol. 10. №4. DOI: 10.2225/vol10-issue4-fulltext-7
5. Chu C.C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops: In: Proc. Symp. Plant Tissue Culture, – Beijing: Science Press, 1978. – P. 43–50.
6. Кedra M., Bach A. Morphogenesis of Lilium martagon L. explants in callus culture// Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. – 2005. – Vol.47. №1. – P. 65-73.
7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// J. Physiol. Plant. –1962. – Vol.15. – P. 473-497.
8. Paunescu A. Biotechnology for Endangered Plant Conservation: A Critical Overview// Rom. Biotechnol. Lett. – 2009. Vol. 14. №1. – P. 4095-4103.
9. Pelkonen V.-P., Kauppi A. The effect of auxins on the regeneration of lily (Lilium regale Wil.) cells by somatic embryogenesis and organogenesis// Int. J. Plant Sci. – 1999. Vol. 160. – P. 483–490.
10. Subotic A., Trifunovic M., Jevremovic S., Petric M. Morpho-histological study of direct somatic embryogenesis in endangered species Frittilaria meleagris// Biol. Plant.– 2010. Vol. 54. №3. – P. 592-596.
L. distichum, L. pumilum  и L. cernuum  (сем. Liliaceae) являются редкими видами азиатской России, нуждающимися в охране. L. distichum, L. pumilum занесены в Красные книги Хабаровского края (2000), Еврейской Автономной области (2006) как исчезающие виды сокращающие численность, тогда как L. cernuum из-за сокращения ареала и численности популяций внесена в Красную книгу РФ (2008).

В условиях интродукции, особенно в климатической зоне средней полосы, возобновление этих видов традиционными способами затруднено [3]. В связи с этим, необходимым является поиск методов размножения лилий, позволяющих не только размножить ценные декоративные растения, но и сохранить их в природе. При выборе стратегии сохранения биоразнообразия редких, исчезающих видов растений многими исследователями показана эффективность методов биотехнологии в сравнении с традиционными способами их размножения [8].

С помощью метода культуры ткани ранее были успешно размножены многие редкие виды лилий: L. martagon L. [6], L. ledebourii (Baker) Boiss [4] и некоторые другие. При использовании эксплантов, представлявших собой ткани либо фрагменты генеративного побега лилий, большинство исследователей отмечали появление регенерантов путем образования адвентивных почек из каллуса, тогда как для сохранения генотипов редких и исчезающих растений предпочтительны методы, позволяющие избежать сомаклональной изменчивости у регенерантов. Необходимость изучения ранних стадий морфогенеза лилий в культуре in vitro с помощью гистологического анализа объясняется тем, что первичные процессы органогенеза в тканях эксплантов, как правило, определяют их дальнейший путь морфогенеза [6]. При использовании флоральных эксплантов редких видов лилий в культуре in vitro исключается возможность повреждения или гибели материнских растений в природе.

Цель исследования – определить особенности регенерации и реализации морфогенетического потенциала различных типов эксплантов, выделенных из цветков 3-х редких видов рода Lilium L. в зависимости от минерального состава питательной среды и внесенных регуляторов роста.

Объекты и методы

Объектами для введения в культуру in vitro являлись три вида из р. Lilium, произрастающие в азиатской части России: L. cernuum Kom..L. distichum Nakai, L. pumilum Delile. L. cernuum и L. distichum получены из природных популяций Дальнего Востока. L. pumilum собрана из окрестностей села Б. Голоустное (западное побережье о. Байкал). Исследования по микроразмножению данных объектов проведены в лаборатории биотехнологии Центрального сибирского ботанического сада. Эксплантами служили различные ткани и органы, выделенные из неокрашенных бутонов трех видов лилий: 1. Поперечные срезы оси соцветия, толщиной 1,5-2 мм; 2. Фрагменты цветоложа такой же толщины; 3. Пыльник с тычиночной нитью и с частью цветоложа. Экспериментальные работы с использованием метода культуры тканей проводили по общепринятым методикам [2]. Для стерилизации бутонов проводили их обработку 96 %-м этанолом в течение 1 мин, далее их обжигали в пламени спиртовки, после чего выдерживали 5 минут в 0,1 %-м водном растворе HgCl2 (0.1%), а затем 4 раза промывали в стерильной дистиллированной воде.

Для инокуляции и культивирования эксплантов использовали две питательные среды: МS [7] и N6 [5] модифицированные нами и обозначенные – МSm и N6m. Модификация состояла в том, что концентрация сахарозы была увеличена до 4%, содержание микросолей и органических компонентов в данных средах было идентично среде MS. Концентрации и компонентный состав макросолей в каждой из сред соответствовал их базовому уровню. Для получения полутвердой питательной среды применяли агар-агар марки «Bacto agar» в концентрации 4-6 г/л. Значение рН сред = 5.7-5,8, продолжительность одного пассажа составляла 3-4 недели. Дальнейшее изучение морфогенетических потенций эксплантов тканей и органов цветков у данного вида лилии было проведено на 4 вариантах питательных сред MSm и N6m, содержавших регуляторы роста 2,4 Д и БАП как по отдельности, так и в комбинации друг с другом.

На всех этапах культивирования растения выращивались: а) при искусственном освещении 40 мкмоль∙м -2/сек-1, 16 часовом фотопериоде и температуре 22 ± 24° С; б) для лучшей адаптации перед высадкой ex vivo растения - регенеранты выдерживали 1-1,5 месяца в световом термостате фирмы Rumed (Германия) при + 7° С. 

Гистологическое изучение тканей регенерантов было выполнено на постоянных препаратах, для дифференцированной окраски на ДНК-РНК ткани окрашивали метиловым зеленым и пиронином. Готовые препараты и образцы тканей просматривали на микроскопе “Axiolab” фирмы “Zeiss” в центре коллективного пользования ЦСБС.

Результаты и обсуждение

Предварительные эксперименты показали, что морфогенетическая реакция вышеуказанных типов эксплантов тканей и органов цветка 3 видов лилий отсутствовала при их инокуляции на среды MSm и N6m без регуляторов роста. Использование таких эксплантов у лилий, как ось соцветия или ткани цветоложа, являющихся органами осевой природы, часто еще не закончивших развитие и не утративших своих морфогенетических способностей, как правило, приводит к образованию микролуковичек непрямым путем, т. е. путем каллусогенеза [9]. В процессе развития регенерантов важно исключить эту стадию, чтобы получить растения-регенеранты идентичные исходному генотипу. Перед нами стояла задача подобрать такие типы эксплантов, которые представляли бы собой индивидуальные органы, выделенные с частью побега, имеющие наибольшую регенерационную способностью без образования каллуса.

Гистологическое изучение тканей эксплантов генеративной сферы L. pumilum, L. cernuum было проведено с целью построения прогнозируемой модели морфогенеза регенерантов, исключающей возможность возникновение сомаклональной изменчивости. Начальные стадии морфогенеза у данных видов лилий in vitro были отмечены образованием скоплений меристематических клеток у эксплантов, выделенных из тканей и органов цветков. На постоянных препаратах делящиеся группы клеток, находящиеся в субэпидермальном слое эксплантов были выявлены благодаря дифференцированной окраске, начиная с 20-25 дня инокуляции, и представляли собой мелкие клетки с хорошо различимыми ядрами, образовывавшие шаровидные структуры, включающие  васкулярные элементы (рис.1). Подобные меристематические структуры были отмечены ранее многими исследователями – [6], [10] на ранних стадиях морфогенетического развития эксплантов луковичных растений в культуре in vitro. В нашем эксперименте эти центры адвентивного побегообразования в дальнейшем давали начало эндогенно образующимся микролуковицам лилий.

           Рис.1. Заложение меристематических центров (МЦ) в паренхиме цветоложа L. pumilum, инокулированного на среду N6m-1, увеличение × 250

 

Отмечено, что образование микролуковичек происходило на всех типах эксплантов, выделенных из цветков 3 видов лилий в большинстве случаев по пути адвентивного побегообразования (гемморизогенеза) как на средах МSm, так и на средах N6m. Минеральная основа среды для инициации, а также концентрация ауксина 2,4- Д оказывали существенное влияние на образование микролуковичек у различного типа эксплантов, взятых из тканей и органов цветка L. pumilum, L.cernuum и L. distichum. Процесс образования побегов и микролуковичек у всех изученных видов лилий происходил более интенсивно на вариантах среды N6m, чем на средах MSm (табл. 1).

              Таблица 1

Влияние минерального состава среды и концентрации 2,4- Д на тип морфогенетической реакции и интенсивность регенерации (шт. микролуковиц на эксплант) у эксплантов тканей и органов цветка Lilium cernuum, L. distichum, L. pumilum, n=24

Виды лилий, типы эксплантов

Варианты питательных сред

MSm-1

MSm-2

N6m-1

N6m-2

0,2 мг/л БАП+ 0,2 мг/л 2,4 Д

0,2 мг/л БАП+ 0,8 мг/л 2,4 Д

0,2 мг/л БАП+ 0,2 мг/л 2,4 Д

0,2 мг/л БАП+ 0,8 мг/л 2,4 Д

1. Фрагм. цветоложа

а) L.cernuum

 

1,0 ± 0,13 По,К

 

1,29±0,17 По,К

 

2,33±0,25 Сэ,К

 

2,72±0,23 По

б) L. distichum

0,25±0,09 По

0,42±0,10 К

1,04±0,15 По

1,75 ±0,17 По

в) L. pumilum

2,30±0,24 К

3,4±0,29 К

3,8±0,30 По

4,2±0,30 По

2. Срез оси соцветия:

а) L.cernuum

 

-

 

-

 

0,5±0,13 К

 

-

б) L. distichum

-

-

-

-

в) L. pumilum

-

-

-

0,75±0,21 По,К

3. Тыч. нить с пыльн. и фрагм.  цветоложа:

а) L.cernuum

 

 

2,0±0,24 По

 

 

1,72,0±0,25 По

 

 

3,21±0,27 По

 

 

3,51±0,22 По

б) L. distichum

1,04±0,15 По

1,20±0,20 По

1,70±0,23 По

3,80±0,33 По

в) L. pumilum

2,70±0,31 По

3,10±0,27 По

3,80±0,30 Сэ

4,12±0,30 По

Примечание :– - отсутствие морфогенетической реакции; По – прямой органогенез; К – каллусогенез; Сэ – соматический эмбриогенез

 

В нашем эксперименте наличие в среде ауксинов и цитокининов и их взаимодействие могло обеспечивать интенсивную индукцию гемморизогенеза как прямым, так и непрямым путем, т.е. путем дедифференциации и каллусогенеза. Каллусообразование отсутствовало только у одного типа эксплантов, а именно, у тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа на всех четырех вариантах сред. Как известно, интенсивность образования каллуса пропорциональна величине раневой поверхности экспланта [1]. Очевидно, что при использовании тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа ткани экспланта данного типа менее всего оказались подвержены поранению. Кроме того, меристематические структуры, как показал гистологический анализ в данной работе, закладывались именно в субэпидермальном слое.

При добавлении к среде N6m ауксина 2,4 Д в сочетании с цитокинином БАП в равных концентрациях (0,2 мг/л) примерно у 20 % эксплантов L. cernuum, представлявших собой тычиночные нити, объединенные с тканью цветоложа и с пыльником, было зафиксировано появление биполярных образований, имевших как зародышевую почечку, так и зародышевый корень, что позволило идентифицировать их как соматические эмбриоиды (рис.2).

 

Рис.2. Образование соматического эмбриоида через 40 дней культивирования тычиночной нити с пыльником и тканью цветоложа L. pumilum на среде N6m + 0,2 мг/л 2,4 Д + 0,2 мг/л БАП; П – почечка; ЗК – зародышевый корень, увеличение ×50

 

            Только в том случае, когда в составе питательной среды концентрация ауксина и цитокинина была одинакова, было отмечено образование соматических эмбриоидов у 2-х видов лилий: L.cernuum и L. distichum (рис.3). Таким образом, очевидно, именно низкая концентрация (0,2 мг/л) ауксина 2,4 Д в составе питательной среды N6m способствовала образованию соматических эмбриоидов как прямым (L. pumilum), так и непрямым путем (L. cernuum).

Рис.3. Образование соматических эмбриоидов из ткани цветоложа L. cernuum на среде N6m с добавлением 0, 2 мг/л 2,4 Д и 0,2 мг/л БАП: ЗК – зародышевый корень; ЗП – зародышевая почечка; увеличение ×10

 

На этапе адаптации полученных микролуковичек 3 редких видов лилий к условиям ex vitro для увеличения их размеров и лучшей укореняемости была произведена холодовая обработка регенерантов, для чего полученные микролуковицы лилий содержались в световом термостате при + 70 в течение от 1 до 1,5 месяца. После адаптации и высадке микролуковиц ex vitro в стерильный песок процент погибших растений составлял не более     5-7 %.

Таким образом, результаты показали, что совместное действие БАП и 2,4 Д обеспечивают регенерацию микролуковичек по пути прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза. Нежелательной дедифференциации тканей эксплантов  при каллусообразовании можно избежать при введении в культуру in vitro эксплантов, объединяющих в себе пыльник с тычиночной нитью и с частью цветоложа. Интенсивность регенерации, измеряемая по количеству микролуковичек, образующихся у различного типа эксплантов, взятых из тканей и органов цветка L. pumilum, L.cernuum и L. distichum зависела от минеральной основы среды, концентрации 2,4 и была больше на среде N6m-2. Гистологический анализ тканей и органов цветка L. pumilum и L. cernuum показал, что начальным этапом морфогенеза при культивировании in vitro данных типов эксплантов, следует считать образование меристематических зон и элементов проводящей системы, развивающихся в дальнейшем в адвентивные побеги. Изучены морфогенетические потенции цветоложа, околоцветников, тычиночных нитей лилий как перспективных эксплантов для сохранения данных видов в природе с помощью методов культуры тканей. При использовании способа размножения фрагментами бутонов in vitro исключается возможность повреждения или гибели растения, являющегося донором экспланта.

Заключение

Установлено, что в культуре тканей и органов цветков видов L. distichum, L. pumilum, L. cernuum возможна реализация процессов как адвентивного органогенеза, соматического эмбриогенеза, так и каллусогенеза. 2. Изучены морфогенетические потенции цветоложа, околоцветников, тычиночных нитей лилий как перспективных эксплантов для сохранения данных видов в природе с помощью методов культуры тканей. Наибольшая регенерационная способность к образованию микролуковичек у всех 3 видов лилий была отмечена у тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа, культивировавшихся на среде N6m, включавшей 0,8 мг/л 2,4 Д и БАП в концентрации 0,2 мг/л. 3. Определен тип эксплантов, представляющий собой сопряженную систему: пыльник – тычиночная нить – ткань цветоложа, с помощью которой получены регенеранты путем прямого органогенеза и соматического эмбриогенеза без фазы каллусообразования. При использовании способа размножения фрагментами бутонов in vitro исключается возможность повреждения или гибели растения, являющегося донором экспланта.

Таким образом, разработана технология клонального микроразмножения 3 видов лилий Сибири и Дальнего Востока от стерильной культуры до растений - регенерантов с использованием в качестве эксплантов тканей и органов цветка.

Рецензенты:

Новикова Т.И., д.б.н., зав. лаборатории биотехнологии ЦСБС СО РАН, г. Новосибирск;

Дорогина О.В., д.б.н., профессор, зав. лаборатории интродукции редких и исчезающих видов растений ЦСБС СО РАН, г. Новосибирск.


Библиографическая ссылка

Набиева А.Ю. РАЗМНОЖЕНИЕ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO LILIUM CERNUUM KOM., LILIUM DISTICHUM NAKAI. И LILIUM PUMILUM DELILE ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭКСПЛАНТОВ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ЦВЕТКА // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=23357 (дата обращения: 23.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074