Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОЙ ФАЗЫ И АКТИВНОСТИ Nа,K-АТФАЗЫ В БОЛЬШИХ ПОЛУШАРИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДИХЛОРЭТАНОМ

Срубилин Д.В. 1 Еникеев Д.А. 1 Мышкин В.А. 2 Хусаинова К.Р. 1 Сазонова М.Р. 1
1 ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России»
2 Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Роспотребнадзора России
Воздействие хронической интоксикации дихлорэтана (ДХЭ) на нервную систему изучено недостаточно. Нервная ткань характеризуется высоким содержанием и разнообразием липидных соединений. Важную роль в обеспечении нормального функционирования нервных клеток играет мембранно-связанный фермент – Nа,К-АТФаза, поэтому цель работы состояла в выяснении некоторых патогенетических механизмов нарушения состояния клеточных мембран головного мозга крыс при хронической интоксикации ДХЭ путем исследования изменения фосфолипид-фосфолипидных соотношений и активности интегрального ионтранспортного белка — Nа,К-АТФазы. Эксперименты проведены на крысах-самцах, у которых моделировали хроническую интоксикацию путем внутрижелудочного введения ДХЭ в дозе 0,01 LD50 в течение 60 суток. При многократном введении ДХЭ наблюдались изменения в распределении фракций фосфолипидов, что обусловливало повышение насыщенности липидного бислоя и увеличение микровязкости мембран. В результате структурной модификации липидного слоя мембран уменьшается активность Na,K-АТФазы головного мозга. Проведенный корреляционный анализ выявил корреляционную связь между активностью Na,K-АТФазы и содержанием лизофосфатидилхолина (r = – 0,89, Р = 0,003) на 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ. Изменения свойств мембран нервных клеток приводят к неврологическим отклонениям и ухудшают ориентировочно-исследовательскую деятельность крыс. Выявленные нарушения клеточных мембран являются важным звеном в патогенезе нейротоксического действия ДХЭ при хронической интоксикации.
корреляция
крысы
К-АТФаза
фосфолипиды
мембрана
дихлорэтан
1. Андреева Н.Н. Коррекция мексидолом постреанимационных изменений липидного обмена мозга / Н.Н. Андреева, И.В. Мухина // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2005. – Т. 68, № 3. – С. 37–41.
2. Волчегорский И.А. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский // Челябинск, 2000. – С. 26–32.
3. Гембицкий Е.В. О механизме токсического действия дихлорэтана / Е.В. Гембицкий, Ю.Ю. Бонитенко // Воен.-мед. журн. – 1983. — № 9. – С. 17–19.
4. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функция / Р. Геннис // М.: Мир, 1997. – 624 с.
5. Идрисова Л.Т. Балльная оценка неврологического статуса крыс при алкогольной коме и влияние на нее лазерной физиогемотерапии / Л.Т. Идрисова, Д.А. Еникеев, Г.А. Байбурина // Клиническая медицина и патофизиология. – 1999. – Т. 32. – С. 75–79.
6. Кейтс М. Техника липидологии / М. Кейтс // М.: Мир, 1975. – 324 с.
7. Климов А.Н. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения / А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева. СПб.: Питер, 1999. – 505 с.
8. Кравец Е.Б. Липидный состав и активность Na,K-АТФазы мембраны эритроцитов у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа при дислипопротеинемиях / Е.Б. Кравец, Е.А. Степовая, Т.Ю. Кощевец и др. // Сахарный диабет. – 2010. – № 1. – С. 41–44.
9. Лужников Е.А. Метаболизм 1,2 дихлорэтана в организме человека после острых отравлений / Е.А. Лужников, Т.А. Лесовик, Т.А. Новиковская // Суд.-мед. экспертиза. – 1985. – № 2. – С. 47–49.
10. Лужников Е.А. Острые отравления: Руководство для врачей. Изд. 2-е, перераб. и доп. / Е.А. Лужников, Л.Г. Костомарова. М.: Медицина, 2000. – 434 с.
11. Молочкина Е.М. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии / Е.М. Молочкина // В сб.: Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. – М.: Наука, 1992. – С. 100–102.
12. Мохамед М.Т. Влияние даларгина на активность Na,К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга при ишемии и реперфузии // М.Т. Мохамед, Н.К. Кличханов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2011. – Т. 13, № 1. – С. 260–263.
13. Новгородцева Т.П. Состав липидов эритроцитов крыс при развитии фиброза печени в условиях алиментарной дислипидемии / Т.П. Новгородцева, Ю.К. Караман, Н.В. Бивалькевич, Н.В. Жукова // Бюллетень СО РАМН. – 2010. — Т. 30, № 1. — С. 53–57.
14. Новицкий В.В. Липидный спектр мембран эритроцитов у онкологических больных / В.В. Новицкий, Е.А. Степовая, Н.Г. Баженова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1998. – Т. 126, № 8. – С. 204–206.
15. Реброва Т.Ю. Особенности фосфолипидного состава мембран эритроцитов в условиях постинфарктного кардиосклероза / Т.Ю. Реброва, Д.С. Кондратьева, С.А. Афанасьев // Сиб. мед. журн. – 2011. – Т. 26, № 1. – С. 131–134.
16. Рязанцева Н.В. Структурные нарушения и изменения активности Na,K-АТФазы в мембране эритроцитов у пациентов с невротическими расстройствами / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – Т. 134, № 7. – С. 85–88.
17. Суняйкина O.A. Иммуномодулирующие эффекты совместного применения регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов Текст. / O.A. Суняйкина, М.В. Павлова, К.И. Суняйкин // Аллергология и иммунология. 2008. — Т. 9, № 3. — С. 359.
18. Толстухина Т.И. Определение Nа,К-ативируемой, Мg-зависимой АТФазной активности в субклеточных фракциях / Т.И. Толстухина // В кн.: Методы биохимических исследований / Под ред. М.И. Прохоровой. – Л., 1982. – С. 258–260.
19. Ansell G.B. Phospholipids and the nervous system / G.B. Ansell, I.N. Hawthorne, R.M.G. Dawson // In: Form and function of phospholipids. – Amsterdam-London. : Elsevier, 1973. – P. 377–422.
20. Bastiaanse E.M. The effects of membrane cholesterol content on ion transport processes in plasma membranes / E.M. Bastiaanse, M. Lars Hold Karin, Arnoud Van Der Laarse // Cardiov. Pes. – 1997. – Vol. 33, № 2. – P. 272–283.
21. Chilton F.N. Lipid mediators of allergic reaction / F.N. Chilton, L.M. Lichtenstein // Chem. Immunol. – 1990. – Vol. 49. – P. 173–205.
22. Domdorf W. Dichloroethane poisoning with myoclonic syndrome, epileptic attacks and irreversible cerebral effects / W. Domdorf // Arch. Psychiatr. Nervenkr. – 1975. – Vol. 220, № 3. – P. 373–379.
23. Farooqui A.A. Glycerophospholipids in brain: their metabolism, incorporation into membranes, functions, and involvement in neurological disorders / A.A. Farooqui, L.A. Horrocks, T. Farooqui // Chem. Phys. Lipids. – 2000. – V. 106, № 1. – P. 1–29.
24. Pacheco M.A. Phosphoinositide signaling in human brain / M.A. Pacheco, R.S. Jope // Progress in Neurobiology. – 1996. – Vol. 50, № 2-3. – P. 255–273.
25. Reisberg B. A 24-Week Open-Label Extension Study of Memantine in Moderate to Severe Alzheimer Disease / B. Reisberg, R. Doody, A. Stoffler et al // Arch. Neurol. – 2006. – Vol. 63. – P. 49–54.
26. Skidmore W.D. Two dimensional thin-layer chromatography of rat liver phosphatides / W.D. Skidmore, C. Entenman // J.Lipid Res. – 19б2. – Vol. 3, № 3. – P. 471–474.
Хлорированные углеводороды, в частности дихлорэтан (ДХЭ), являются одними из наиболее токсичных веществ, широко используемыми в быту и промышленности. Обмен ДХЭ происходит по схеме летального синтеза. Основными метаболитами являются: 2-хлорэтанол, хлоруксусный альдегид, монохлоруксусная кислота, которые значительно токсичнее ДХЭ. Попадая внутрь организма, ДХЭ как гидрофобное вещество быстро исчезает из крови, накапливаясь в тканях, богатых липидами: нервной системе, печени, сальнике, надпочечниках, откуда выводится в течение нескольких дней. При сохраняющейся высокой летальности от острых интоксикаций ДХЭ наиболее часто встречаются состояния, связанные с длительным поступлением токсиканта в организм. При этом способ введения ДХЭ, как показали многочисленные наблюдения, не оказывает существенного влияния на распределение его метаболитов [3, 9, 10, 22].

 Считается, что основным патогенетическим звеном токсического действия ДХЭ на организм является поражение печени, поскольку именно этот орган играет ведущую роль в процессе его превращения. Воздействие хронической интоксикации ДХЭ на нервную систему изучено недостаточно. Нервная ткань характеризуется высоким содержанием и разнообразием липидных соединений, которые определяют ее морфологическую гетерогенность, метаболизм и функциональную активность. Фосфолипиды являются главными липидными компонентами клеточных мембран, они создают достаточно стойкие двухслойные мембранные структуры, обладающие в то же время необходимой текучестью и обеспечивающие нормальную работу белковых мембранных структур, регулирующих проницаемость ионов и веществ. Фосфолипиды являются предшественниками вторичных мессенджеров и биологически активных соединений, участвующих в механизмах синаптической трансмиссии, процессах адаптации и патогенезе различных заболеваний центральной нервной системы [15, 23]. Важную роль в обеспечении нормального функционирования нервных клеток играет мембранно-связанный фермент – Nа,К-АТФаза, участвующий в регуляции распределения катионов натрия и калия между клеткой и межклеточным пространством и определяющий биоэлектрические свойства мембран нервных клеток. Вместе с тем комплексная оценка повреждений клеточных мембран головного мозга с учетом деятельности мембранно-зависимых ферментных систем при хронической интоксикации ДХЭ в доступной нам литературе не встречается.

 В связи с вышеизложенным целью настоящей работы являлось выяснение некоторых патогенетических механизмов нарушения состояния клеточных мембран головного мозга крыс при хронической интоксикации ДХЭ путем исследования изменения фосфолипид-фосфолипидных соотношений и активности интегрального ионтранспортного белка - Nа,К-АТФазы.

 Материалы и методы исследования

 Эксперименты выполнены на 48 здоровых половозрелых неинбредных белых крысах-самцах массой 180–220 г, разделенных на 3 группы: 1-я – контрольная (n=16), 2-я и 3-я – животные с моделированной интоксикацией дихлорэтаном (n=16 в каждой группе) соответственно на 30-е и 60-е сутки исследования. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.83 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.03 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных». Хроническая интоксикация дихлорэтаном достигалась ежедневным энтеральным введением токсиканта в растворе оливкового масла в дозе 5 мг/кг (0,01 LD 50) в течение 60 суток. Контрольные животные получали внутрижелудочно равный объем оливкового масла. Животных умерщвляли методом краниоцервикальной дислокации под легким эфирным наркозом. Объектом исследования служили большие полушария головного мозга. Эксперименты выполнялись в осенне-зимний период времени. Забор биологического материала производился в утренние часы. Тестирование осуществляли на 30-е и 60-е сутки.

 Экстракцию липидов из полушарий головного мозга производили по методу Folch J. Для разделения фосфолипидов на классы использовали метод восходящей хроматографии в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ: метанол: 7н аммиак в объемных соотношениях 60:35:5, предложенной Скидморе и Энтенманом [26]. Хроматограммы проявляли парами йода. Идентификацию фракций фосфолипидов (ФЛ) проводили при помощи качественных (цветных) реакций, измерением величины Rf. Фосфолипиды, содержащие свободные аминогруппы – фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и фосфатидилсерин (ФС), определяли с помощью нингидрина, холинсодержащие фосфолипиды (фосфотидилхолин, лизофосфатидилхолин, сфингомиелин) определяли при помощи реактива Драгендорфа. Для определения монофосфоинозитидов использовали аммиачный раствор серебра, состоящий из равных объемов 0,1 н AgNO3 и 1 н NH3, а для обнаружения фосфатидов использовали хлорид железа (FeCl3) и сульфосалициловую кислоту [6]. Минерализацию липидного фосфора проводили в среде хлорной кислоты с последующим проведением «цветной» реакции с образованием молибденовой сини [11]. Содержание фосфолипидов выражали в мкг липидного фосфора на 1 г влажной ткани с последующим определением коэффициентов их соотношений. Суммарные ФЛ вычисляли по сумме отдельных фракций.

 Получение мембранных препаратов больших полушарий головного мозга крыс проводили из 10% гомогенатов на среде выделения, содержащей 0,03 М сахарозы с 0,01 М триса и 0,005 М ЭДТА (рН 7,5) методом дифференциального центрифугирования. Активность Na,K-АТФазы в мембранах оценивали, измеряя количество неорганического фосфата, который освобождается в ходе гидролиза АТФ. Общую АТФазную активность определяли в среде следующего состава (в мМ): трис – 50, NaCl – 100, KCl – 20, MgCl2 – 3, АТФ – 3 (рН 7,5) и 40–50 мкг мембранного белка в 1 мл конечного объема. Реакцию начинали внесением субстрата и инкубировали 15 мин при 37оС, останавливали реакцию добавлением холодного раствора трихлоруксусной кислоты (конечная концентрация 5%). При определении активности Mg2+-АТФазы среда инкубации содержала те же компоненты и дополнительно 1мМ уабаина для ингибирования активности Na,K-АТФазы. Активность Na,K-АТФазы рассчитывали как разность между общей и Mg2+-зависимой АТФазной активностью [18]. Содержание белка определяли по Лоури. Количественное определение фосфата проводили методом Ратбуна и Бетлаха, который позволяет определять неорганический фосфат в присутствии АТФ.

 Ориентировочно-исследовательские реакции оценивали по тесту «открытое поле» [5], а неврологические нарушения — по методу [2].

 Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. После проверки нормальности распределения изучаемых параметров в сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин (m) при соответствии распределения признака закону нормального распределения с расчетом сравнения групп показателей по критерию Стьюдента (t). Минимальный уровень статистически значимых различий верифицировали при р<0,05. Взаимосвязь признаков оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением стандартных пакетов программы Statistica 6.0 и программного обеспечения Microsoft Excel.

 Результаты исследования и их обсуждение

 Для нервной ткани характерно высокое содержание фосфолипидов. В мозге фосфолипиды составляют 65–70% суммарного веса всех липидов. Являясь важным структурным компонентом плазматических мембран, фосфолипиды регулируют активный и пассивный трансмембранный транспорт веществ, определяют чувствительность клеток к действию лигандов, детерминируют активность мембранно-связанных ферментных систем [4, 19]. Анализ полученных результатов, представленный в таблице 1, свидетельствует о значительных качественных и количественных изменениях в фосфолипидном составе полушарий головного мозга крыс на 30-е сутки хронической интоксикации ДХЭ на фоне незначительного уменьшения содержания суммарных фосфолипидов (СФЛ). Разделение смеси фосфолипидов полушарий головного мозга крыс экспериментальных групп показало наличие семи компонентов: фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилсерина (ФС), сфингомиелина (СМ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ), фосфатидных кислот (ФК), монофосфоинозитида (МФИ).

 Таблица 1

Содержание отдельных представителей фосфолипидов в больших полушариях головного мозга крыс при хронической интоксикации ДХЭ (M±m)

Исследуемый показатель

Группы животных

1-я группа, (n=16)

2-я группа, (n=16)

3-я группа, (n=16)

Суммарные фосфолипиды, мкг Р на г. влажной ткани

2167,5±26,95

2006,7±69,45*

1785,1±29,0*^

Фракции ФЛ

 

ЛФХ

мкг Р на 1 г влажной ткани

54,4±4,3

63,3±4,29

70,2±4,93

в % от липидного фосфора

2,52±0,21

3,14±0,13*

3,93±0,26*^

ФХ

мкг Р на 1 г влажной ткани

944,04±28,7

809,9±36,3

779,66±25,26

в % от липидного фосфора

43,53±1,05

40,33±1,06

43,7±1,3

ФЭ

мкг Р на 1 г влажной ткани

622,78±14,7

484,46±19,9

452,15±16,29

в % от липидного фосфора

28,72±0,49

24,13±0,51*

25,35±0,89*

ФС

мкг Р на 1 г влажной ткани

218,85±11,9

288,3±12,23

167,3±11,87

в % от липидного фосфора

10,14±0,64

14,38±0,41*

9,36±0,62^

СМ

мкг Р на 1 г влажной ткани

168,03±11,17

180,13±8,47

168,38±7,4

в % от липидного фосфора

7,74±0,49

9,0±0,37

9,44±0,41*

МФИ

мкг Р на 1 г влажной ткани

118,13±6,56

130,06±8,6

89,76±7,63

в % от липидного фосфора

5,49±0,29

6,5±0,4

5,02±0,4^

ФК

мкг Р на 1 г влажной ткани

40,93±2,63

50,55±3,94

57,64±5,4

в % от липидного фосфора

1,89±0,11

2,52±0,18*

3,22±0,28*

Коэффициент ЛФХ/ФХ, усл.ед.

0,059±0,0054

0,078±0,003*

0,091±0,007*

Коэффициент ФХ/СМ, усл.ед.

5,84±0,5

4,57±0,3*

4,73±0,33

Коэффициент ФЭ/ФС, усл.ед.

2,92±0,2

1,69±0,062*

2,8±0,22^

Коэффициент ФХ/ФК, усл.ед.

23,54±1,24

16,7±1,44*

14,35±1,3*

Коэффициент ФЭ+ФС/ФХ+СМ, усл. ед.

0,76±0,066

0,78±0,022

0,66±0,029*^

 

 

 

 

 

           

 Примечание: * — достоверно (p<0,05) по сравнению с первой (контрольной) группой в процентном соотношении от липидного фосфора

 ^ — достоверно (p<0,05) 3-я группа по сравнению со 2-й группой в процентном соотношении от липидного фосфора

 При изучении фосфолипидного спектра наблюдалось перераспределение состава ФЛ в сторону накопления ЛФХ, СМ, ФС и снижения доли ФХ и ФЭ. Анализ фосфолипидного состава выявил снижение содержания легкоокисляемой фракции фосфатидилхолина (ФХ) на 7,4% (р>0,05) с одновременным ростом образования ЛФХ на 24,6% (р<0,05), который является специфическим маркером фосфолипазной активности. Увеличение коэффициента ЛФХ/ФХ на 32,2% (р<0,05) свидетельствует об интенсификации процессов деацилирования фосфолипидов, при котором образуются неэстерифицированные жирные кислоты, вступающие в окислительные процессы, связанные с активацией ПОЛ и образованием малонового диальдегида. Недостаток ФХ в наружном слое мембран эритроцитов компенсировался за счет повышения количества СМ. Сфингомиелин является медленно обменивающимся ФЛ головного мозга, не содержащим полиеновые кислоты. В силу высокой насыщенности сфингомиелина в кластеры, которые образует этот фосфолипид в мембране, встраивается большое количество холестерина, что влечет за собой уменьшение проницаемости клеточной мембраны, нарушение процессов активного транспорта, переноса веществ [13]. При интоксикации ДХЭ коэффициент ФХ/СМ, характеризующий уровень перераспределения фосфолипидных фракций внутри мембранного бислоя, составил 4,57 условных единиц. Снижение этого коэффициента на 21,7% (р<0,05) в сравнении с группой здоровых животных свидетельствует об уменьшении жидкостных свойств и увеличении микровязкости липидной фазы мембраны.

 Фосфолипидные фракции ФЭ и ФС характеризуют внутренний монослой мембраны. Количество ФЭ уменьшилось на 16,0% (р<0,001), а содержание ФС возросло на 41,8% (р<0,001). Расчет коэффициента ФЭ/ФС показал, что при интоксикации ДХЭ его величина составляет 1,69 усл.ед., что ниже показателей контрольной группы на 42,1% (р<0,001). Увеличение ФС на фоне снижения содержания ФХ и ФЭ является защитно-приспособительной реакцией клеток, обеспечивающей регуляцию микровязкости липидного компонента мембраны [1, 7, 20]; в какой-то мере увеличение ФС частично нивелировало потерю ФХ и ФЭ. Повышение количества ФС возможно за счет реакции обмена азотистыми основаниями между ФХ, ФЭ и ФС, осуществляемыми холин-специфической и этанол-специфической фосфатидилсеринсинтетазами [7]. В условиях нашего эксперимента снижается коэффициент соотношений ФХ/ФК на 29,1% (р<0,01), что свидетельствует о существенном подавлении процессов синтеза мембранных глицеролипидов. Известно, что ФК обладают высокой скоростью метаболизма и играют значительную роль в биосинтезе других фосфолипидов [7]. Поэтому повышение ФК является как следствием деградации фосфолипидов, так и результатом нарушения синтетических процессов. Следует отметить повышенное содержание МФИ в головном мозге у крыс на 30-е сутки хронической интоксикации ДХЭ. Монофосфоинозитид, участвуя в фосфатозитидном цикле, влияет на организацию холинорецептора и тем самым отвечает за синаптическую передачу нервного импульса [4, 24]. Выявленная модификация фосфолипидного матрикса клетки свидетельствует о структурно-функциональной несостоятельности цитоплазматической мембраны.

 Таким образом, на 30-е сутки хронической интоксикации ДХЭ у крыс развиваются адаптационные изменения в фосфолипидном спектре головного мозга, однако при этом превалирует деградация фосфолипидов. Полагают, что деградация фосфолипидного состава является одной из причин повышения ХС в мембране при патологии. В результате повышенной активности фосфолиполиза и свободно-радикального окисления происходит разрушение фосфолипидных молекул, вследствие чего уменьшается их содержание в мембране, они замещаются на молекулы ХС [8].

 На 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ направленность изменений в фосфолипидном составе полушарий головного мозга была однотипной с 30-ми сутками интоксикации, но эти изменения были более выраженными. Уменьшение содержания суммарных фосфолипидов составило 17,64% (р<0,05). Однако снижение содержания ФЭ сопровождалось одновременным уменьшением количества ФС на 34,6% (р<0,001) относительно 2-й группы животных. Данное обстоятельство можно связать с тем, что они наиболее быстро подвергаются окислению свободными радикалами при усилении процессов перекисного окисления липидов. Снижение содержания ФС, а также значительное накопление ФК свидетельствуют о делипидизации мембран, что можно трактовать как срыв защитно-приспособительных реакций. Содержание монофосфоинозитида на 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ снизилось на 22,77% (р<0,05) относительно животных 2-й группы. Фосфоинозитиды и их метаболиты принимают участие в реализации действия нейромедиаторов на молекулярном уровне, а также являются одним из поставщиков арахидоновой кислоты и эйкозаноидов и тем самым играют важную роль в обеспечении нормального функционирования нервных клеток [17, 21, 25].

 Важным показателем, характеризующим лабильность липидного бислоя, служит коэффициент асимметрии (ФЭ+ФС)/(ФХ+СМ). Отношение суммы фосфолипидов с меньшей насыщенностью жирных кислот, которые располагаются преимущественно во внутреннем монослое липидного бислоя мембран, к фосфолипидам с большей насыщенностью, которые располагаются во внешнем монослое, позволяет получить представления о жидкостности мембраны. На 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ значение коэффициента асимметрии ниже контрольной величины на 13,2% (р<0,05), что обусловливает повышение насыщенности липидного бислоя и увеличение микровязкости.

 В результате структурной модификации липидного слоя мембраны изменяется конформация встроенных в них белков. Известно, что активность и свойства транспортных АТФаз плазматических мембран в значительной степени определяются структурными особенностями липидного матрикса, в который погружены молекулы фермента [16]. Исходя из этого нами была проведена оценка активности липидзависимых и мембраносвязанных ферментных систем – ионтранспортных АТФаз клеточных мембран головного мозга. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о снижении активности Na,K-АТФазы на 16,42% (р<0,05) на 30-е сутки интоксикации ДХЭ с одновременным повышением общей АТФазной активности и деятельности Мg АТФаз. На 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ активность Na,K-АТФазы снизилась на 20,16% (р<0,05), при этом наблюдалось заметное ингибирование общей АТФазной активности и деятельности Мg АТФаз. Возрастание содержания лизофракций в мембранах делает возможным переход липидного бислоя в монослой с нарушением проницаемости мембраны для ионов Nа+ и К+, образованием гидрофильных каналов и солюбилизацией ферментов [14]. Дезорганизация липидного слоя мембраны может явиться причиной утраты способности клеток регулировать ионный гомеостаз. Проведенный нами корреляционный анализ выявил корреляционную связь между активностью Na,K-АТФазы и содержанием ЛФХ ( r=–0,89, р=0,003) на 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ.

 Таблица 2

АТФазная активность мембран из больших полушарий головного мозга крыс при хронической интоксикации ДХЭ (M±m)

Исследуемый показатель

Группы животных

1-я группа (n=16)

2-я группа (n=16)

3-я группа (n=16)

АТФаза (общая),

мкмоль Рi · мг белка-1 · ч -1

18,81±0,5

19,65±0,73

16,11±0,56*^

Мg-АТФаза

мкмоль Рi · мг белка-1 · ч -1

12,66±0,52

14,51±0,52*

11,2±0,57^

Na,К-АТФаза

мкмоль Рi · мг белка-1 · ч -1

6,15±0,3

5,14±0,35*

4,91±0,36*

Примечание: * — достоверно (p<0,05) по сравнению с 1-й (контрольной) группой

 ^ — достоверно (p<0,05) 3-й группы по сравнению со 2-й группой

 Na+,K+насос формирует на мембране нервной клетки электрохимический градиент, энергия которого используется для процессов возбуждения, транспорта аминокислот, сахаров и других метаболитов через плазматическую мембрану. Ингибирование фермента снижает трансмембранные градиенты ионов, вызывает чрезмерное поступление в нейроны Nа+ с последующим притоком Cl¯ и воды, что приводит к клеточному отеку [12]. Изменения биоэлектрических свойств мембран нервных клеток создают предпосылки для развития функциональных расстройств со стороны ЦНС. В серии экспериментов были оценены неврологические отклонения и ориентировочно-исследовательская деятельность у крыс при хронической интоксикации ДХЭ. При оценке неврологического статуса крыс особое внимание уделяется поведенческим реакциям животных, изменениям рефлекторной деятельности, координационно-двигательным расстройствам. При этом отражается состояние различных уровней центральной нервной системы. Иерархия уровней включает спинной мозг (рефлекс сгибания), продолговатый мозг (роговичный рефлекс), средний мозг (рефлекс равновесия, зрачковые реакции) и кору головного мозга (реакция постановки лап на опору, хватание, тесты для исследования равновесия). Динамика показателей неврологического статуса показана на рисунке 1, из которого следует, что у животных на 30-е сутки хронической интоксикации ДХЭ развивается неврологический дефицит легкой степени. При углублении интоксикации на 60-е сутки действия ДХЭ неврологический дефицит становится более выраженным, увеличиваясь до 32,13±4,77 баллов (р<0,05).

Рис. 1. Показатели неврологического статуса (баллы) у крыс при хронической интоксикации ДХЭ (n=8 в каждой группе)

 Ориентировочно-исследовательская деятельность крыс на 30-е сутки хронической интоксикации ДХЭ характеризуется угнетением всех ее составляющих (рис. 2, 3). Возрастает продолжительность латентного периода с 5,5±0,94 до 13,25 с (р<0,05), снижается горизонтальная (количество пересеченных линий) и вертикальная (количество вертикальных стоек) двигательная активность на 20,55% (р<0,05) и 19,0% (р<0,05) соответственно, количество обследованных норок уменьшается в 1,63 раза (р<0,05), наблюдаются значительные изменения в эмоциональном компоненте (груминг). На 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ изменения в ориентировочно-исследовательской активности у крыс были однонаправленными с 30-ми сутками, но более выраженными.

Рис. 2. Показатели горизонтальной, вертикальной активности и количество обследованных норок у крыс при хронической интоксикации ДХЭ (n=8 в каждой группе)

Рис. 3. Показатели длительности латентного периода и груминга (секунд) у крыс при хронической интоксикации ДХЭ (n=8 в каждой группе)

 Таким образом, полученные нами данные позволяют считать, что клеточные мембраны головного мозга при хронической интоксикации ДХЭ претерпевают существенные изменения. В результате структурных нарушений мембран нервных клеток могут изменяться их функциональные свойства, способность регулировать ионный гомеостаз, что в конечном счете может привести к значительным метаболическим и функциональным расстройствам. Выявленные нарушения клеточных мембран являются важным звеном в патогенезе нейротоксического действия ДХЭ при хронической интоксикации. Степень выраженности структурно-функциональных изменений мембран зависит от длительности патологического процесса.

Рецензенты:

Миннебаев М.М., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань;

Фролов Б.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия», г. Оренбург.

 


Библиографическая ссылка

Срубилин Д.В., Еникеев Д.А., Мышкин В.А., Хусаинова К.Р., Сазонова М.Р. ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОЙ ФАЗЫ И АКТИВНОСТИ Nа,K-АТФАЗЫ В БОЛЬШИХ ПОЛУШАРИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДИХЛОРЭТАНОМ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22886 (дата обращения: 23.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074