Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,682

РОЛЬ ТЕМПЕРАТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ В ПЕРСИСТЕНЦИИ И БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ

Сизова Ю.В. 1 Черепахина И.Я. 1 Бурлакова О.С. 1
1 ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Биопленочное сообщество – одна из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. С учетом значимости проблемы выяснения закономерностей персистенции холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов были проведены опыты по оценке влияния стрессовых температурных условий на персистенцию и процесс биопленкообразования холерных вибрионов. В результате проведенных исследований было показано, что эпидемически значимые токсигенные холерные вибрионы в условиях стерильной речной воды достаточно быстро (в течение 2–3 месяцев) погибают, причем гибель идет тем быстрее, чем ниже температура. Это свидетельствует об ограниченной возможности персистенции эпидемически значимых холерных вибрионов в водоемах Российской Федерации в холодное время года. При этом показатели выживаемости коррелируют с показателями биопленкообразования. Непатогенные и условно эпидемически значимые вибрионы выживают в речной воде и сохраняют биопленки достаточно продолжительное время, что свидетельствует о выраженном персистентном потенциале.
биопленка
холерный вибрион
персистенция
1. Алексеева Л.П., Чемисова О.С., Мазрухо Б.Л., Шестиалтынова И.С., Михалева В.В., Татаренко О.А., Маркина О.В. К вопросу о способности холерных вибрионов эльтор продуцировать экзополисахарид // Холера и патогенные для человека вибрионы. – 2007. – № 20. – С. 77-80.
2. Балахнова В.В., Бурлакова О.С., Подройкина В.А. Способность к формированию биопленок у холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. – С.-Петербург, 2010. – С. 92-94.
3. Белобородова Н.В. Клиническое значение микробных биопленок // Российские медицинские вести. – 2010. – Т. XV, № 4. – С. 68-72.
4. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. – 2004. – Т. 40, № 11. – С. 1445-1456.
5. Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я., Марамович А.С., Миронова Л.В., Саппо С.Г. Способность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп к образованию биопленки в эксперименте // Холера и патогенные для человека вибрионы. – 2009. – № 22. – С. 90-93.
6. Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я., Саппо С.Г., Миронова Л.В., Марков Е.Ю., Мальник В.В., Корзун В.М., Миткеева С.К., Балахонов С.В. Биопленка холерного вибриона: получение, характеристика и роль резервации возбудителя в водной окружающей среде // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2015. – № 1. – С. 3-11.
7. Лямин А.В., Боткин Е.А., Жестков А.В. Проблемы в медицине, связанные с бактериальными пленками // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2012. – Т. 14, № 4. – С. 268-275.
8. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms // Clinical Microbiology. – 2002. – Vol. 7. – P. 167-193.
9. Gander S. Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents // J. Antimicrob. Chemother. – 1996. – Vol. 37. – Р.1047-1050.
10. Yildiz F.H., Visick K.L. Vibrio biofilms: so much the same yet so different // Trends Microbiol. – 2009. – Vol. 17. – P. 109-118.

Как известно, большинство бактерий существует в виде биопленок, образуемых на самых разных биотических и абиотических поверхностях. Развитие биопленочных сообществ – одна из основных стратегий выживания бактерий не только в организмах инфицируемых хозяев, но и в окружающей среде [3]. В составе биопленок бактерии отличаются значительной устойчивостью к действию антибактериальных препаратов, включая антибиотики и факторы иммунной защиты организма, а также к воздействию факторов окружающей среды, таких как изменения температуры, рН среды, осмолярности. Выживаемость бактерий биопленочных сообществ в различных стрессовых условиях обеспечивается сложной структурной организацией биопленок [8].

Основным фактором устойчивости биопленок является экзополисахаридный матрикс, вырабатываемый клетками бактерий сразу после прикрепления к субстрату. Он непостоянен по составу и меняется в результате адаптации бактерий к условиям окружающей среды, основу его составляют экзополисахариды, липополисахариды, гликопротеины и протеогликаны [4,9]. Эти биополимеры в микробной пленке действуют как молекулярное сито, улавливая и концентрируя питательные вещества из окружающей среды, а также ограничивая проникновение агрессивных агентов к бактериям в глубине биопленки [7].

Механизм и особенности формирования биопленок у холерных вибрионов в эксперименте достаточно хорошо изучены [5,10]. Однако свойства холерных вибрионов при персистенции их в биопленках и влияние на процесс их образования различных стрессорных факторов исследованы недостаточно [1,2,6]. Мало изучен вопрос о роли низкотемпературного стресса в выживании планктонных и биопленочных форм холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов, а эти сведения чрезвычайно важны при планировании мероприятий по эпиднадзору за холерой в Российской Федерации.

Цель исследования: с учетом значимости проблемы выяснения закономерностей персистенции холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов провести масштабные по продолжительности эксперименты (9 месяцев) по оценке влияния стрессовых температурных условий на процесс биопленкообразования.

Материалы и методы: в работе использовано 22 штамма Vibrio cholerae Эль Тор, имеющих различный набор детерминант патогенности, выделенных от больных, вибриононосителей и из речной воды. Для решения поставленных задач холерные вибрионы инкубировали в стерильной речной воде (конечная концентрация 1*107 м.к./мл) в холодильнике при +40С и в комнатном термостате при +220С в течение 9 месяцев, а также (при моделировании условий пребывания возбудителя холеры в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время) эксперимент продолжали 2 месяца при 22 0С, 2 месяца – при 10 0С, 5 месяцев – при 4 0С. Ежемесячно производили высевы на агар Мартена для определения количества планктонных форм холерных вибрионов, а также определяли оптическую плотность биопленок на спектрофотометре Cary50.

Результаты исследования

В первой серии опытов, проводимых с использованием речной воды (таблица 1, рисунок 1), установлено, что у токсигенных (ctx+tcp+) штаммов при 22 0С на протяжении всего срока исследования количество клеток в популяции, начиная с конца первого месяца эксперимента, постепенно снижалось (20 %→0,15 %), при этом вибрионы формировали «слабые» биопленки (значения оптической плотности (ОП) были низкими и лишь незначительно увеличивались к 4–5 месяцу исследования). При стрессовой низкой температуре (4 0С) все токсигенные штаммы практически отмирали к 3 месяцу исследования (выжившие клетки при этой температуре составляли всего десятые доли процента, возможно часть популяции при этом переходила в некультивируемое состояние. Сведения о такой возможности приводятся в работах Е.С. Куликаловой с соавт. [5,6]. Кроме этого, показано, что при 4 0С токсигенные холерные вибрионы формировали через 1–2 месяца, наряду с типичными колониями, «ругозные» варианты, которые постепенно отмирали в стрессовых условиях.

Таблица 1

Средние значения выживаемости холерных вибрионов в речной воде в течение 9 месяцев при 22ºС и 4ºС   

срок культиви-рования, месяцы

Ранжирование штаммов по эпидемической значимости

Температура культивирования 22ºС

Температура культивирования 4ºС

ctx+tcp+

ctx-tcp+

ctx-tcp-

ctx+tcp+

ctx-tcp+

ctx-tcp-

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

1

2*106

20

6,4*106

64

3*106

30

2,2*105

2,2

5,5*106

55

5*106

50

2

1*105

1

5*106

50

2,7*106

27

1,2*104

0,12

4,2*106

42

3,6*106

36

3

1*105

1

3*106

30

1,4*106

14

0

0

3*106

30

2*106

20

4

1*105

1

4,5*106

45

1,8*106

18

0

0

3,5*106

35

2*106

20

5

4*104

0,4

3*106

30

1*106

10

0

0

3*106

30

1,5*106

15

6

3,5*104

0,35

2,6*106

26

8*105

8

0

0

6*105

6

9*105

9

7

2*104

0,2

1,5*106

15

3*105

3

0

0

5,6*105

5,6

1*106

10

8

1*104

0,1

1*106

10

2*105

2

0

0

5*105

5

7,5*105

7,5

9

1,5*104

0,15

1*106

10

1,5*105

1,5

0

0

7*104

0,7

5*105

5

Рисунок 1. Сравнение уровней биопленкообразования у вибрионов Эль Тор в речной воде при 22 ºС и 4 ºС в течение 9 месяцев

У атоксигенных (ctx-tcp-) вибрионов, напротив, бóльшая часть популяции сохранялась при 4ºС на протяжении всего срока исследования (к концу 9 месяца показатели биопленкообразования были выше, чем в тех же условиях при 22ºС). То же касается и выживаемости – она была выше в холодной воде (5 % против 1,5 %).

Потенциально эпидемически опасные вибрионы (ctx-tcp+) сохранялись при обеих температурах на протяжении всего срока исследования, но продукция экзополисахарида была гораздо выше при 22 ºС. В процессе культивирования при 4 ºС уровень биопленкообразования этих штаммов несколько увеличивался к 4 месяцу, а затем существенно снижался. К концу 9 месяца при 22 ºС выживало 10 % популяции клеток (наиболее высокий показатель среды всех изучаемых вибрионов), при 4 ºС – всего 0,7 % (но это значение всего в 7 раз ниже, чем у нетоксигенных штаммов. Это свидетельствует о достаточно высоком персистентном потенциале ctx-tcp+ вариантов.

Для выяснения «судьбы» холерных вибрионов различной эпидемической значимости при попадании в речную воду в летнее время был проведен длительный эксперимент по моделированию условий пребывания в ней холерных вибрионов Эль Тор в летнее, осеннее, зимнее время при разных температурах (2 месяца – 22 ºС, 2 месяца – 10 0С, 5 месяцев – 4 ºС). Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 2.

Таблица 2

Средние значения выживаемости холерных вибрионов в речной воде при различных температурах в разные сроки  

Наличие генов

Температура

22 ºС

10 ºС

4 ºС

Месяцы

1

2

3

4

5

6

7

8

9

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

ctx+tcp+

2*106

20

1,2*105

1,2

6,1*103

0,06

9*101

0,00 09

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

ctx-tcp+

6,4*106

64

5*106

50

6,4*105

6,4

5*105

5

1,3*105

1,3

8,2*104

0,82

6*104

0,6

4,4*104

0,44

3,2*104

0,32

ctx-tcp-

3*106

30

2,5*106

25

4*105

4

4,6*105

4,6

2*105

2

2,8*105

2,8

2,4*105

2,4

2*105

2

1,8*105

1,8

Рисунок 2. Биопленкообразование вибрионов Эль Тор в речной воде в течение 9 месяцев при изменении температуры культивирования

Токсигенные холерные вибрионы при постепенном снижении температуры выживали только при температурах 22 ºС и 10 ºС (при этом к концу 4 месяца высевалось лишь 0,0009 % клеток), при 4 ºС живых клеток обнаружено не было. Снижение количества живых вибрионов в речной воде коррелировало со снижением показателей биопленкообразования (показатели ОП на всем протяжении были низкими, и после 4 месяцев были отрицательными, т.е. биопленки отсутствовали).

Атоксигенные штаммы сохранялись на протяжении всего эксперимента, хотя количество клеток к концу исследования было сравнительно невелико (0,8 % от исходного показателя). Что же касается биопленок, то их значения в этой группе штаммов к концу исследования при 4 ºС были выше, чем в начале эксперимента, вероятно, в результате адаптации к стрессовым условиям обитания.

Высоко устойчивыми к стрессу оказались потенциально эпидемически опасные штаммы, лишенные генов токсинообразования, но способными их приобрести при определенных условиях за счет токсинкорегулируемых пилей алгезии. Эти вибрионы выживали на протяжении всего срока исследования (хотя к концу эксперимента сохранилось всего 0,3 % планктонных клеток). На протяжении 7 месяцев персистирования в воде при разных температурах эти штаммы формировали самые «мощные» биопленки (показатели ОП – самые высокие), затем значения постепенно снижались.

Таким образом, можно констатировать, что эпидемически значимые токсигенные холерные вибрионы в условиях стерильной речной воды достаточно быстро (в течение 2–3 месяцев) погибают, гибель идет тем быстрее, чем ниже температура. Показатели выживания коррелируют с показателями биопленкообразования, т.к. ctx+tcp+ варианты не формируют в условиях низкотемпературного стресса экзополисахарид. В речной воде с резкими колебаниями температуры в присутствии антагонистических факторов циркуляция токсигенных холерных вибрионов еще более ограничена. В эндемичных очагах холеры при высокой температуре речной воды персистенция токсигенных вариантов может быть достаточно длительной.

Непатогенные и условно эпидемически значимые вибрионы выживают в речной воде и сохраняют биопленки достаточно продолжительное время, что свидетельствует о выраженном персистентном потенциале.

Рецензенты:

Терентьев А.Н., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории диагностики ООИ. ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону;

Павлович Н.В., д.м.н., старший научный сотрудник, заведующая лаборатории туляремии ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону.


Библиографическая ссылка

Сизова Ю.В., Черепахина И.Я., Бурлакова О.С. РОЛЬ ТЕМПЕРАТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ В ПЕРСИСТЕНЦИИ И БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=22554 (дата обращения: 21.11.2018).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252