Сетевое научное издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Златник Е.Ю. 1, Бахтин А.В. 1, Кочуев С.С. 1, Новикова И.А. 1, Селютина О.Н. 1, Непомнящая Е.М. 1, Пржедецкий Ю.В. 1, Позднякова В.В. 1, Захарова Н.А. 1

---

1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России

Изучали состояние локального клеточного иммунитета у 30 больных меланомой кожи с различной глубиной инвазии. Использовали метод проточной цитофлюориметрии с подсчетом лимфоцитов различных субпопуляций в гомогенатах опухолевой ткани и перитуморальной области. Полученные результаты показывают более высокий уровень Т-лимфоцитов (CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, T-regs) в опухолевой ткани, наряду с более низким содержанием в ней В- и NК-клеток по сравнению с кровью. Популяционный состав лимфоцитов перитуморальной области частично схож с составом опухолевой ткани, однако накопление в ней CD3+CD4+ не сопровождается столь высоким уровнем их минорной субпопуляции (T-regs), как в ткани меланомы, что позволяет предположить избирательность миграции последних в опухолевую ткань. Более глубокая инвазия меланомы сопровождается низким уровнем Т- и высоким уровнем NК-клеток в ткани опухоли.

Статья в формате PDF

267 KB

меланома кожи

глубина инвазии

локальный клеточный иммунитет

T-regs

1. Данилова А.Б., Данилов А.О., Балдуева И.А., Нехаева Т.Л., Новик А.В., Комаров Ю.И. Предиктивное значение изменения экспрессии опухолеассоциированных антигенов и продукции иммуносупрессирующих факторов опухолевыми клетками в процессе культивирования и создания противоопухолевых вакцин // Вопросы онкологии. — 2013. — Т. 59. — Приложение к № 3. — С. 1160—1161.

2. Палкина Н.В., Швецова Ю.И., Кириченко А.К., Рукша Т.Г. Ингибирование матриксных металлопротеиназ 9-го и 13-го типов влияет на выраженность лимфоцитарной инфильтрации и уровни экспрессии микроРНК miR-21 и miR-let-7b в клетках меланомы in vivo // Архив патологии. - 2015. - N 1. - С. 41-47.

3. Селькова М.С., Селютин А.В., Сельков С.А. Особенности содержания Т-регуляторных лимфоцитов и NК-клеток у пациентов с хроническим гепатитом С // Инфекции и иммунитет. - 2012. - Т. 2, № 4. - С. 715-722.

4. Фильчаков Ф.В., Грабовой А.Н., Лён А.Д., Кукушкина С.Н., Коровин С.И., Кукушкина М.Н., Весельская В.Н., Таран Л.Н. Локальный иммунный ответ у больных меланомой кожи: связь с эффективностью интерферонотерапии // Клин. онкол. - 2014. - № 4 (16). – С. 12-16.

5. Франциянц Е.М., Комарова Е.Ф., Бандовкина В.А., Позднякова В.В., Черярина Н.Д. Уровень некоторых опухолевых маркеров в ткани меланомы кожи, ее перифокальной зоны и по линии резекции // Молекулярная медицина. – 2014. - № 3. – С. 57-60.

6. Curiel T.J., Coukos S., Zou L et al. Specific recruitment of regulatory T-cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival // Nat. Med. - 2004. - V. 10. - P. 942-949.

7. Fazekas St., Groth B., Zhu E., Asad S., Lee L. Flow cytometric detection of human regulatory T-cells. // Methods Mol. Biol. - 2011. - V. 114, № 9. - P. 1209-1217.

8. Mizukami Y., Kono K., Kavaguchi Y. et al. CCL17 and CCL22 chemokines within tumor microenvironment are related to accumulation of FoxP3+ regulatory T-cells in gastric cancer // Int. J. Cancer. - 2008. - V. 122. - P. 2286-2293.

9. Uzdensky A., Demyanenko S., Bibov M., Sharifulina S., Kit O., Przhedetski Y., Pozdnyakova V. Expression of proteins involved in epigenetic regulation in human cutaneous melanoma and peritumoral skin // Tumor Biology. - Springer, 2014.

10. Wang E., Panelli M.C., Zavaglia K. et al. (2004) Melanoma-restricted genes // J. Transl. Med. - 2: 34–40.

Меланома кожи является одной из наиболее неблагоприятно протекающих и плохо поддающихся лечению злокачественных опухолей. При этом от многих других опухолей ее отличает доказанная иммуногенность вследствие экспрессии различных, в частности раково-тестикулярных антигенов, которые изучены и описаны в литературе [9]. Особенности инфильтрации опухоли лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, оценка ее роли в прогрессии или регрессии опухоли, ее возможное прогностическое значение привлекают внимание ряда авторов [1]. Характеристика иммунологического микроокружения рассматривается как важный прогностический признак при иммунотерапии меланомы [3; 6]. В аспекте взаимодействия опухоли и организма опухоленосителя представляет особый интерес состояние перитуморальной области меланомы [4; 10].

Основными критериями при установлении стадии и расчете прогноза заболевания являются такие морфологические характеристики меланомы, как глубина инвазии по Кларку и толщина опухоли по Бреслоу. Первый критерий определяет уровень распространения злокачественного процесса в нижележащие слои дермы и основан на анатомическом строении кожи. Толщина опухоли по Бреслоу характеризует наибольший вертикальный размер меланомы в миллиметрах.

Целью данной работы является исследование особенностей лимфоцитарного состава опухолевой ткани и перитуморальной области меланомы кожи с различной толщиной опухоли по Бреслоу и глубиной инвазии по Кларку.

Материалы и методы

Объектом изучения были фрагменты ткани опухоли и перитуморальной области, а также кровь 30 пациентов с меланомой кожи (18 женщин и 12 мужчин в возрасте от 31 до 82 лет), госпитализированных в отделение опухолей кожи, мягких тканей и молочной железы № 2 Ростовского научно-исследовательского онкологического института с октября 2014 по июль 2015 г. У 3 больных патологический очаг локализовался на верхних конечностях, у 11 на нижних, у 2 на волосистой части головы, у 12 на туловище, у 2 на лице. По морфологической форме преобладала узловая меланома с толщиной от 1 до 15 мм по Бреслоу и II-V уровнем инвазии по Кларку. Одна пациентка имела отдаленные метастазы в легкие, у четверых больных установлено метастатическое поражение регионарного коллектора. Все случаи заболевания были первичными, неоадъювантного лечения не проводилось. Больным было выполнено хирургическое лечение в объеме широкого иссечения опухоли с пластикой местными тканями (15), свободным кожным лоскутом (10), встречными кожно-жировыми лоскутами (1), ротационным кожно-жировым лоскутом (3), серповидным кожно-жировым лоскутом (1). Пациентам с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах дополнительно проводилась лимфодиссекция. Исследование факторов общего и локального клеточного иммунитета проводили не позднее, чем через час после хирургического лечения на свежем послеоперационном материале и крови, взятой перед проведением операции. Кровь у больных брали из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Удаленные опухоли подвергались патоморфологическому исследованию; кроме того, отдельные фрагменты опухолевой ткани и перитуморальной зоны (ПЗ, визуально неизменной ткани, прилежащей к опухоли) гомогенизировали с помощью дезагрегирующего устройства BD Medimachine. В крови и в гомогенатах тканей определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов на проточном цитометре FACSCantoII (BD) с панелью антител T-, B-, NK (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD16/56), дополнительно изучали количественное содержание Т-регуляторных (T-regs) клеток (CD4+CD25+CD127dim). Несмотря на то что наиболее распространенным методом определения последних является подсчет клеток с фенотипом CD4+CD25brightFoxP3+, в литературе есть данные о приемлемости для этой цели фенотипа CD4+CD25+CD127dim [2; 7].

Результаты выражали в процентах от общего количества лимфоцитов, а для T-regs в процентах от CD3+CD4+ клеток. Статистическую обработку данных выполняли с помощью параметрических и непараметрических методов (t-критерий Стьюдента, критерий Уилкоксона, метод непрямых разностей).

Результаты

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови, опухоли и перитуморальной зоны по всей группе больных представлены в табл. 1 и на рис. 1. Следует отметить, что не у всех больных в тканевых образцах были выявлены лимфоциты в количестве, достаточном для проточной цитофлюориметрии. Так, из 30 образцов опухолей лимфоциты были обнаружены в 23, а в перитуморальной области – только в 13 образцах.

Таблица 1

Сравнительная характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов крови, опухоли и перитуморальной зоны при меланоме кожи (%)

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей крови; ** - статистически достоверные отличия от показателей перитуморальной зоны (р<0,05).

Как видно из табл. 1, наблюдается ряд различий лимфоцитарного состава опухоли и ее окружения от соответствующих показателей крови. Так, уровень Т-лимфоцитов в опухоли статистически достоверно выше, чем в крови, за счет CD3+CD8+ клеток, а содержание В- и NК-лимфоцитов – ниже. В опухоли отмечено накопление T-regs, количество которых в процентах от CD3+CD4+ клеток оказалось в 3 раза выше, чем в крови, хотя по общему уровню CD3+CD4+ лимфоцитов кровь и опухолевая ткань не имели статистически достоверных различий.

Состав лимфоцитарных популяций и субпопуляций ткани перитуморальной зоны демонстрирует ряд отличий от показателей как крови, так и опухолевой ткани (табл. 1, рис. 1). По сравнению с кровью в ней выявлено статистически значимо больше CD3+ клеток за счет CD3+CD4+ и меньше В-(CD19+) лимфоцитов. По сравнению с тканью опухоли перитуморальная область содержит меньше CD3+ и CD3+CD8+ лимфоцитов, а также T-regs на фоне более высокого уровня CD3+CD4+ клеток. В перитуморальной зоне выявлено также статистически достоверно более высокое содержание CD16/56+ клеток, чем в опухоли: происходит постепенное снижение их уровня от периферической крови через перитуморальную зону к ткани опухоли, причем такая направленность противоположна наблюдаемой для T-regs (рис. 1).

Рис. 1. Процентное содержание лимфоцитов некоторых субпопуляций в крови и в тканях меланомы и ее перитуморальной области

Для анализа показателей иммунного статуса у больных с различным уровнем инвазии меланомы по Бреслоу были выделены 3 группы больных: с инвазией 1-3, 3-10 и больше 10 мм. Сравнительная характеристика их иммунологических показателей приведена в табл. 2, на рис. 2.

Таблица 2

Показатели общего и локального иммунитета у больных меланомой кожи при разной толщине опухоли по Бреслоу (%)

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей крови; ** - статистически достоверные отличия от показателей перитуморальной зоны; • - статистически достоверные различия между группами (опухоль); º - статистически достоверные различия между группами (перитуморальная зона) (р<0,05).

Как видно из табл. 2, не наблюдается статистически достоверных различий исследуемых показателей в крови, кроме уровня лимфоцитов, который был выше при минимальной глубине инвазии опухоли (30,9±2,3, 23,7±1,5 и 21,9±2,6% соответственно; р<0,05).

В ткани опухоли и перитуморальной зоны обнаружены различия: при нарастании инвазии уменьшается количество Т-лимфоцитов и повышается содержание NК-клеток. Различия по уровню T-regs в опухоли статистически недостоверны, но выявлена тенденция к их более высокому содержанию в опухолях с более глубокой инвазией. При инвазии 1-3 мм 4 из исследованных показателей в опухолевой ткани отличаются от крови: содержание Т-лимфоцитов, в частности CD3+CD8+, было выше, а уровни CD16/56+ и CD19+ ниже, чем в крови. При инвазии 3-10 мм к аналогичным различиям добавляется статистически значимо более высокое по сравнению с кровью содержание T-regs, а максимальная глубина инвазии сопровождается более низким уровнем в опухолевой ткани CD3+CD4+ лимфоцитов при высоком проценте T-regs; количество NК-клеток не отличается от показателя крови. Подобные различия прослеживаются и в перитуморальной зоне: так, при минимальной инвазии в ней содержится статистически достоверно больше CD3+ и CD3+CD4+ лимфоцитов и меньше NК-клеток, чем при меланоме с инвазией свыше 10 мм (табл. 2).

При сравнении факторов локального иммунитета у больных с различной инвазией по Кларку выявлены подобные закономерности: в опухоли находится больше Т-клеток, чем в крови, преимущественно за счет CD3+CD8+ и T-regs, и меньше CD19+ и CD16/56+ (табл. 3). В перитуморальной зоне отмечено повышение уровней CD3+CD4+ лимфоцитов по сравнению с кровью, хотя не во всех группах статистически достоверно подтвержденное.

Таблица 3

Показатели общего и локального иммунитета у больных меланомой кожи при разной глубине инвазии опухоли по Кларку (%)

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей крови; ** - статистически достоверные отличия от показателей перитуморальной зоны; • - статистически достоверные различия между группами (опухоль); º - статистически достоверные различия между группами (кровь) (р<0,05).

Отмечен ряд различий между группами в зависимости от степени инвазии по Кларку: при III степени в опухоли наблюдался более высокий уровень CD3+CD4+ лимфоцитов по сравнению с IV и V степенью, а уровень CD3+CD8+ клеток был максимальным в опухолях с IV степенью инвазии. Сходная картина наблюдалась и в крови: у больных с IV степенью инвазии содержание CD3+CD8+ было статистически значимо выше, а CD3+CD4+ ниже, чем при III степени инвазии; однако при инвазии V степени не наблюдалось отличий от III (табл. 3).

На рис. 2 представлено сравнение исследованных факторов локального клеточного иммунитета в ткани меланомы кожи с различной глубиной инвазии по Бреслоу и по Кларку: показаны как сходные закономерности, так и различия.

 А

 Б

Рис. 2. Процентное содержание лимфоцитов некоторых субпопуляций в ткани меланомы при различной толщине опухоли по Бреслоу (А) и глубине инвазии по Кларку (Б)

Так, при более глубокой инвазии опухоли по обоим критериям отмечено снижение уровня CD3+ и CD3+CD4+ клеток и повышение содержания CD16/56+ лимфоцитов. При этом наблюдались разноречивые данные по количеству CD3+CD8+ клеток, демонстрирующему различия только при сравнении опухолей с различной глубиной инвазии по Кларку и по Т-regs, содержание которых было высоким вне зависимости от ее нарастания (рис. 2Б).

При сопоставлении иммунологических показателей в ткани поверхностных и узловых форм меланомы кожи также выявлен ряд различий, менее выраженных для крови, чем для опухолевой ткани. Так, в крови отмечено статистически достоверно более высокое количество лимфоцитов у больных с поверхностной формой меланомы кожи, чем с узловой (33,3±2,8 и 23,6±1,2% соответственно; р<0,05). В ткани опухоли у тех же больных выявлено по сравнению с узловой формой меланомы более высокое содержание Т-лимфоцитов (93,6±0,9 и 88,1±2,1% соответственно) и более низкое NК-клеток (0,9±0,1 и 6,4±1,8% соответственно), а также T-regs (10,6±3,3 и 19,8±2,5% соответственно); для данных показателей различия статистически достоверны (р<0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Процентное содержание лимфоцитов некоторых субпопуляций в ткани меланомы при ее различных формах

Итак, в опухолевой ткани меланомы кожи присутствуют Т-лимфоциты обеих основных субпопуляций, потенциально обладающие способностью к распознаванию антигенов, продукции цитокинов, а также цитотоксичостью (CD3+CD4+ и CD3+CD8+); однако их наличие не реализуется в виде противоопухолевого действия. Причина этого, по-видимому, состоит в том, что, несмотря сходное процентное содержание CD3+CD4+ клеток в крови и в ткани меланомы, уровень их минорной субпопуляции T-regs в последней значительно выше, тогда как CD3+CD4+ концентрируются в перитуморальной области. Можно предположить избирательность миграции T-regs в опухолевую ткань вследствие взаимодействия их мембранных рецепторов с хемокинами, что описано в литературе на примере рака яичника [5] и желудка [8]. Неожиданной находкой явился низкий уровень NК-клеток в ткани меланомы с меньшей глубиной инвазии и его повышение при более глубоком прорастании. Однако с учетом значительного уровня в ней T-regs и данных литературы об их ингибирующем действии в отношении естественных киллеров [2], можно предположить, что их присутствие в опухоли препятствует проявлению цитолитической активности последних.

Рецензенты:

Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии с курсом онкологии и детской онкологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Голотина Л.Ю., д.м.н., профессор, ассистент кафедры онкологии с курсом онкологии и детской онкологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.

Библиографическая ссылка