Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Фомина А.А. 1 Малинин М.Л. 2 Коннова С.А. 3 Тихомирова Е.И. 1

---

1 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю.А.»

2 ФГБНУ «Саратовский НИВИ Россельхозакадемии»

3 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»

Исследовано влияние введения липополисахарида (ЛПС) Azospirillum lipoferum Sp59b в дозе 0,1 мкг/мышь на активность ключевых ферментов метаболизма экспериментальных животных. При изучении острой токсичности ЛПС на мышах определена LD50, которая составила 8,9 мкг, что указывает на слабую токсичность препарата по сравнению с классическим эндотоксином ЛПС Escherichia coli 055:В5. Активность ряда важнейших ферментов углеводного обмена (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, креатинкиназы, лактатдегидрогеназы) была понижена при введении ЛПС, что свидетельствует о возрастании анаболических процессов биосинтеза органических веществ в организме мышей. Не установлены серьезные нарушения в функционировании сердечной мышцы, признаки острой почечной и печеночной недостаточности у животных под действием ЛПС. Показано, что препарат стимулирует продукцию нитрогенных форм внутри клеток, однако мало влияет на кислородзависимые бактерицидные механизмы в макрофагах мышей.

Статья в формате PDF

146 KB

липополисахарид

Azospirillum

ферменты

метаболизм

иммуностимулятор

1. Игнатов В.В., Коннова О.Н., Бойко А.С., Фомина А.А., Федоненко Ю.П., Коннова С.А. Характеристика составов жирных кислот липидов А липополисахаридов бактерий рода Azospirillum // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. – 2009. – Т. 9. – Вып. 1. – С. 36–41.

2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / В.С. Камышников. – Минск: Беларусь, 2000. – Т. 1. – 495 с.

3. Лабораторная гематология / С.А. Луговская [и др.]. – М.: Юнимед-пресс, 2002. – 115 с.

4. Практикум по иммунологии / Под ред. Кондратьевой И.А., Самуилова В.Д. – M.: МГУ, 2001. – 224 с.

5. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология. – 1978. – № 4. – С. 497–502.

6. Фомина А.А., Малинин М.Л., Коннова С.А., Тихомирова Е.И. Биохимические и гематологические показатели у мышей при введении ЛПС Azospirillum brasilense Sp245 // Токсикологический вестник. – 2009. – № 6. – C. 52–53.

7. Фомина А.А., Петров А.В., Коннова С.А., Бойко А.С., Федоненко Ю.П., Тихомирова Е.И., Симбирцев А.С. Влияние ЛПС азоспирилл на активность факторов неспецифической резистентности макроорганизма // Цитокины и воспаление. – 2009. – Т. 8. – № 4. – С. 23–27.

8. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний и животных // Успехи современной биологии. – 2003. – Т. 123. – № 1. – С. 31–40.

9. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Konnova S.A., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V., Knirel Yu.A. Structure of the O-specific polysaccharide from the lipopolysaccharide of Azospirillum lipoferum Sp59b // Carbohydrate Research. – 2005. – V. 340. –P. 1259–1263.

10. Komaniecka I., Zdzisinska B., Kandefer-Szerszen M., Choma A. Low endotoxic activity of lipopolysaccharides isolated from Bradyrhizobium, Mesorhizobium, and Azospirillum strains // Microbiol Immunol. 2010;54(12):717-25.

11. Lucy M., Reed E., Glik R. Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria // Ant.van Leeuwenhoek. − 2004. −V.86. − P. 1–25.

Липополисахариды (ЛПС) являются неотъемлемыми компонентами оболочки грамотрицательных бактерий, в том числе и ассоциативных свободноживущих ризобактерий рода Azospirillum. Данный род микроорганизмов широко распространен в природе и активно используется в последнее время в качестве компонентов биоудобрений [11]. Известно, что азоспириллы способны экскретировать ЛПС в составе ЛПБК в окружающую среду, однако механизм и степень их воздействия на макроорганизмы слабо изучены.

ЛПС обладает свойствами эндотоксина и способен индуцировать ряд биологических процессов: активацию макрофагов и лейкоцитов, cтимуляцию продукции эндогенного пирогена, интерферона, интерлейкинов и других медиаторов, активацию синтеза белков острой фазы, митогенный эффект и иное вплоть до эндотоксинового шока и острой полиорганной недостаточности. Тем не менее воздействие эндотоксинов на организм оценивается неоднозначно [8]. Биологический эффект ЛПС в отношении теплокровных животных и человека в значительной степени зависит от его состава и структуры, а также от концентрации полимера. Ранее в исследованиях in vitro нами было показано, что ЛПС Azospirillum lipoferum Sp59b (ЛПС_Sp59b) в диапазоне концентраций 0,01-1 мкг/мл активирует процесс фагоцитоза, стимулирует продукцию миелопероксидазы макрофагами, индуцирует синтез основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1b, ИЛ-8 и ФНО-a клетками цельной крови человека, а также оказывает выраженное пролиферативное действие на мышиные спленоциты [7]. В связи с этим целью данной работы стало выявление влияния ЛПС_Sp59b in vivo на активность ключевых ферментов белкового, углеводного, липидного обменов, а также на метаболическое состояние лейкоцитов белых мышей.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали 42 лабораторные белые мыши весом 18-21 г, содержание и эвтаназия которых соответствовали требованиям Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 ЕЕС. Острую токсичность ЛПС_Sp59b определяли при однократном внутрибрюшинном введении мышам, предварительно сенсибилизированным 3,2%-ным D-галактозамингидрохлоридом [5].

Для исследований активности ЛПС препарат вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 0,1 мкг/мышь. Через 1, 3 и 5 суток животных умерщвляли методом транслокации шейных позвонков. Перитонеальные макрофаги, спленоциты и кровь выделяли из организма мышей по общепринятым методикам [4]. Биохимические исследования сыворотки крови выполняли с использованием полуавтоматического биохимического анализатора BS 3000 Р Sinnova, КНР. Активность аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ), общей кислой фосфатазы (КФ), липазы, а также содержание глюкозы, общего белка, альбумина, глобулина, мочевины, креатинина, общего холестерина, a-холестерина, железа и ионизированного кальция определяли стандартными общепринятыми методиками [2]. Для более полной характеристики метаболического статуса животных вычисляли интегральный показатель энергетического обмена - индекс ферментемии по формуле: ИФ = АСТ/АЛТ + АСТ/ЛДГ + КК/ЛДГ. Гемоглобин исследовали гемиглобинцианидным методом D.L. Drabkin, а количество лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева [3]. Активность миелопероксидазы (МПО) и продукцию активных форм кислорода (АФК) в перитонеальных макрофагах оценивали спектрофотометрически. Интенсивность продукции NO спленоцитами определяли методом Грисса. Полученные данные подвергали статистической обработке стандартными методиками.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование физиологической активности ЛПС имеет практический интерес только в том случае, если предполагаемый протекторный эффект препарата сочетается с его низкой собственной токсичностью. В предварительных экспериментах при изучении острой токсичности ЛПС_Sp59b  на мышах определена LD₅₀, которая составила 8,9 мкг, что было в 60 раз меньше по сравнению с действием классического эндотоксина ЛПС Escherichia coli 055:В5. Полученные данные свидетельствуют о слабой токсичности препарата ЛПС_Sp59b, состав жирных кислот липида А и структура О-специфического полисахарида которого исследованы ранее [1, 9]. Данные о низкой токсичности препаратов ЛПС_Sp59b азоспирилл коррелируют с результатами, полученными для ЛПС штамма A. brasilense Sp245 [6], а также данными польских коллег [10].

Для исследования выбрано внутрибрюшинное введение препарата в дозе 0,1 мкг/мышь, поскольку данная концентрация в экспериментах in vitro индуцировала достоверные изменения иммунологических и биохимических показателей в клетках человека и экспериментальных животных. Сроки наблюдения (1-е, 3-и и 5-е сутки) определили исходя из известных данных о возникновении обменных нарушений в течение первых суток после попадания классического эндотоксина в организм, а на 3-5-е сутки приходится начало восстановительных процессов.

Установлено, что активность аминотрансфераз АСТ- и АЛТ-ферментов, осуществляющих взаимосвязь между обменом азотистых соединений и углеводов, была достоверно понижена по сравнению с контролем уже через 1 сутки после введения ЛПС_Sp59b и оставалась приблизительно на данном уровне на 3-и и 5-е сутки действия препарата (табл.). На фоне введения ЛПС_Sp59b показано значительное понижение активности КК (в 4-11 раз) по сравнению с контролем и как следствие - снижение синтеза макроэргического соединения - креатинфосфата. В то же время отмечено достоверное уменьшение активности конечного фермента гликолиза ЛДГ в 2-3 раза у опытных мышей по сравнению с интактной группой животных. Полученные результаты по низкой активности ряда важнейших ферментов углеводного обмена свидетельствуют о значительном энергетическом голодании клеток на фоне введения исследуемого ЛПС.

Таблица

Влияние ЛПС_59b на биохимические, гематологические показатели сыворотки крови и функционально-метаболическое состояние мышиных лейкоцитов

* - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05

Для более полной оценки метаболического состояния животных был использован индекс ферментации, который позволяет судить об активности центральных и периферических зон метаболизма. Показано, что ИФ снижался в 1,6 раза у животных к 1-м и 5-м суткам после введения ЛПС, а на 3-и сутки незначительно отличался от контроля. Пониженные значения ИФ в сыворотке крови указывают на возрастание анаболических процессов биосинтеза органических веществ в организме мышей под действием препарата. Данная особенность воздействия ЛПС азоспирилл на активность метаболизма животных была установлена нами ранее при исследовании ЛПС A. brasilense Sp245 [6].

Показано, что при введении ЛПС_Sp59b в организм белых мышей активность ЩФ увеличивалась в 3 раза на 1-е сутки по сравнению с контролем и оставалась высокой и к 5-м суткам действия препарата; при этом активность КФ на 1-е сутки введения ЛПС была на уровне контрольных значений, а к 3-м и 5-м суткам ее активность уменьшалась в 1,5-2 раза. Полученные результаты косвенно свидетельствуют о конкуренции ферментов за высокоэнергетический креатинфосфат, так как фосфатазы в организме конкурируют с креатинкиназой за неорганический фосфат. Креатинфосфат, помимо участия в энергетическом обмене, является важнейшим мембранопротектором. Снижение его концентрации сопровождается увеличением цитолиза.

Установлено, что содержание важнейшего диагностического показателя гомеостаза макроорганизма - общего белка в сыворотке крови опытных животных при введении им препарата практически не изменялось на протяжении всего периода исследования. Концентрация альбумина достоверно увеличивалась только на 5-е сутки эксперимента, при этом концентрация глобулина уменьшалась значительно (в 4,5 раза) к 3-м суткам и в 2,5 раза к 5-м суткам действия препарата по сравнению с контролем. Повышенные концентрации фракции глобулинов в сыворотке крови свидетельствуют о резком выбросе белков острой фазы при воспалении, а пониженное их содержание может указывать на увеличение моноцитарно-макрофагальной функции печени. Полученные данные по ряду показателей сыворотки крови мышей при введении им ЛПС_Sp59b: незначительное уменьшение общего холестерина к 5-м суткам, не изменяющее содержание общего белка, повышенная концентрация альбумина - могут свидетельствовать о нормальном функционировании печени животных.

Показатели азотистого обмена (мочевину и креатинин) исследовали для оценки функционального состояния почек и исключения почечной недостаточности. При введении ЛПС_Sp59b содержание мочевины в сыворотке крови мышей было достоверно ниже контрольных значений (в 1,3-2 раза) на протяжении 5 суток исследования, что подтверждает метаболический сдвиг в сторону пластического обмена, однако показатели находятся в пределах нормы (2,5-8,3 мМ/л). Концентрация креатинина в сыворотке экспериментальных животных достоверно не изменялась по сравнению с контролем, что является положительным признаком, поскольку повышенное содержание креатинина непосредственно указывает на развитие почечной недостаточности у животных и человека.

Установлено, что состояние гипогликемии возникло у мышей только на 3-и сутки после введения ЛПС_Sp59b (содержание глюкозы ниже 3,3 ммоль/л), однако к 5-м суткам ее содержание повысилось на 65%. Характерно, что именно на 3-и сутки наблюдались минимальные значения активности АЛТ и общего белка. В совокупности со снижением концентрации глюкозы это может указывать на некоторое разобщение углеводного и белкового обмена, что в свою очередь способствует адаптации животных к неблагоприятным условиям.

Активность липазы в сыворотке крови мышей после введения ЛПС_Sp59b была снижена в 2 раза на протяжении 5 суток исследования. Следовательно, интенсивность β-окисления жирных кислот, которые могли бы стать источником ацетил-коэнзима А, идущего далее в цикл Кребса, не повышалась. Установлено, что ЛПС_Sp59b обладает антиатерогенными свойствами. Уровень a-холестерина - холестерина липопротеинов высокой плотности, которые транспортируют его от клеток периферических органов к печени, где он переводится в желчные кислоты и выводится из организма, - повышался в 1,5 раза по сравнению с контролем к 5-м суткам действия ЛПС_Sp59b. Индекс атерогенности при введении ЛПС_Sp59b значительно снижался по сравнению с контролем, особенно на 1-е сутки действия препарата. Определение холестерина крови является важным этапом диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы, атеросклероза и заболеваний печени.

При изучении влияния ЛПС_Sp59b на гематологические показатели у белых мышей установлено (табл.), что содержание гемоглобина в крови увеличивалось на 1-е сутки на 20% и составляло 141±3,0 г/л, а позже уменьшалось до нормативных значений. В то же самое время концентрация железа последовательно увеличивалась к 5-м суткам после введения препарата животным. Стоит отметить, что содержание железа в крови во многом зависит от уровня гемоглобина. Как правило, распад гемоглобина ведет к высвобождению данного элемента. Количество лейкоцитов достоверно снижалось на 3-и и 5-е сутки после введения ЛПС_Sp59b по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении маргинального пула лейкоцитов. Грамотрицательный септис часто сопровождается гипокальциемией в связи с выходом кальция через нарушенную систему микроциркуляции, а также нарушением гемодинамики. В наших исследованиях содержание кальция в крови мышей было достоверно выше контроля в 1,5-2 раза на протяжении всего периода исследования действия ЛПС_Sp59b.

Одновременно нами было проведено исследование специфических ферментативных систем мышиных лейкоцитов для оценки их функционального состояния (табл.). Показано, что введение ЛПС_Sp59b значительно активировало образование NO мышиными спленоцитами (в 4 раза больше по сравнению с контролем только к 3-м суткам); к 5-м суткам содержание NO уменьшалось, однако оставалось достоверно выше контроля (в 2 раза). NO является противоспалительным и цитотоксическим в отношении опухолевых клеток фактором, а также индикатором активности индуцибельной NO-синтазы. В отношении механизмов кислородзависимого киллинга препарат не проявил значительного эффекта: содержание АФК в НСТ-тесте с мышиными макрофагами незначительно увеличивалось к 5-м суткам действия препарата, а активность МПО увеличивалась достоверно на 3-и сутки введения ЛПС, а к 5-м суткам находилась на уровне контроля.

Таким образом, в ходе исследования активности основных ферментов обменных процессов белых мышей при введении им ЛПС_Sp59b в концентрации 0,1 мкг/мышь не установлены серьезные нарушения в функционировании сердечной мышцы, признаки острой почечной и печеночной недостаточности. Однако понижение активности ряда ключевых ферментов углеводного обмена свидетельствует об энергетической недостаточности клеток макроорганизма при воздействии препарата. Показано, что ЛПС_Sp59b смещает метаболические процессы у белых мышей в сторону пластического обмена. При изучении функционально-метаболического состояния выделенных лейкоцитов установлено, что ЛПС_Sp59b in vivo значительно стимулирует продукцию нитрогенных форм внутри клеток, однако мало влияет на кислородзависимые бактерицидные механизмы в макрофагах. Результаты, полученные в ходе этих и ранее проведенных исследований ЛПС_Sp59b in vivo и in vitro, свидетельствуют о низкой токсичности препарата и перспективности использования ЛПС азоспирилл в малых дозах в качестве индукторов факторов неспецифической резистентности.

Рецензенты:

Карпунина Л.В., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», г. Саратов;

Шелудько А.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, г. Саратов.

Библиографическая ссылка