Проблема создания современных отечественных импортозамещающих лекарственных средств является одной из актуальных задач современной фармации. Одним из перспективных в этом отношении лекарственных растений является календула лекарственная (ноготки) (Calendula officinalis L.). Цветки ноготков применяются в качестве официнального лекарственного растительного сырья (ЛРС) в Российской Федерации и во многих странах мира. Препараты календулы широко используются в отечественной и в европейской медицине в качестве противовоспалительных лекарственных средств, обладающих регенерирующей, желчегонной, отхаркивающей активностью [5, 8].
Однако, несмотря на пристальное внимание ученых к проблемам стандартизации сырья и фитопрепаратов календулы, до сих пор наблюдается очевидная противоречивость в подходах к фармакогностическому исследованию растения [1–4, 8–10]. На фоне популярности и востребованности лекарственных средств на основе цветков ноготков представляется целесообразным обобщить имеющиеся мировой опыт и оценить с точки зрения соответствия методик нормативной документации (НД) современным требованиям к фармацевтическому анализу, а также обсудить результаты собственных исследований по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов данного растения.
При рассмотрении было обнаружено, что фармакопейная статья 5 «Цветки ноготков» Государственной фармакопеи СССР XI издания предполагает анализ ЛРС только по содержанию экстрактивных веществ, при этом отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» [2].
В отношении лекарственных средств на основе календулы (настойка, экстракт) также не применяются адекватные методики анализа, поскольку предлагаемые показатели не дают объективной оценки качества фитопрепаратов «Календулы настойка», «Календулы экстракт жидкий». Так, если с реакцией подлинности с концентрированной серной кислотой на сапонины можно согласиться, поскольку она направлена на определение третьей группы действующих веществ — сапонинов, вносящих вклад в фармакологическую активность, то использование реакции на дубильные вещества с хлоридом окисного железа не представляется специфичным для данного вида ЛРС. Качество данных препаратов оценивается по содержанию суммы окисленных веществ [5], что не соответствует современным представлениям о химической природе биологически активных соединений цветков календулы лекарственной.
При рассмотрении нормативной документации других стран были выявлены следующие подходы к стандартизации календулы лекарственной.
Требования к сырью в Европейской и Британской фармакопеях полностью совпадают [9]. Идентификацию воздушно-сухого сырья проводят по внешним признакам сырья, а также методом микроскопии с использованием раствора хлоралгидрата. Для качественного анализа используется тонкослойная хроматография (ТСХ) при 365 нм. Раствором сравнения является смесь кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты и рутина в метаноле. Система растворителей: муравьиная кислота безводная: вода:этилацетат 10:10:80. На наш взгляд, стандарты, используемые в методике ТСХ-анализа, не обеспечивают специфичность ЛРС. В соответствии с вышеуказанными зарубежными фармакопеями количественное определение проводят на спектрофотометре при длине волны 425 нм. При этом для количественной характеристики используется содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид (не менее 0,4%). Расчет содержания суммы флавоноидов проводится на вещество гиперозид, не содержащийся в цветках календулы лекарственной. Раздел «Числовые показатели» представлен такими характеристиками, как: посторонние примеси (цветоложе с обвертками — не более 5%; другие примеси – не более 2%), потеря в массе при высушивании (не более 12%) и зола общая (не более 10%) [9].
Стандартизация цветков календулы в государственной фармакопее Республики Казахстан сформулирована по аналогии с подходами Европейской фармакопеи. В данной НД также проводят испытания на микробиологическую чистоту, тяжелые металлы и радионуклиды [1].
В Государственной фармакопее Украины в отношении настойки календулы предлагается проводить идентификацию методом ТСХ по таким действующим веществам, как флавоноиды и сапонины (календулозиды — производные олеаноловой кислоты) [3].
Кроме того, календула лекарственная является популярным растением в гомеопатии. Так, растение входит в Немецкую гомеопатическую фармакопею [10]. При этом в документации в качестве сырья указана вся надземная часть растения в период цветения, а не только цветки, как в фармакопеях других государств. Фармакопейная статья календулы лекарственной в Немецкой гомеопатической фармакопее представлена подробным описанием внешних признаков всей надземной цветущей части данного растения. Кроме того, в этом документе также приводится характеристика матричной настойки. Анализ данной лекарственной формы проводится с помощью метода ТСХ (детекция при 254 нм). В качестве контрольного раствора используют раствор галловой кислоты в метаноле, что не обеспечивает специфичность [10].
В результате ранее проведенных фитохимических исследований было достоверно установлено, что доминирующим и диагностическим веществом цветков календулы является флавоноид нарциссин (3-рутинозид-изорамнетина) [6, 7]. Данное диагностическое вещество было впервые выделено в Российской Федерации из данного растения методом колоночной хроматографии. Методом 1Н-ЯМР и масс-спектрометрии было установлено химическое строение выделенного соединения [6]. Сравнение полученного нами доминирующего флавоноида с ГСО рутином методом ТСХ (Rf около 0,4), хроматографическая система хлороформ-метанол-вода (26:14:3) по хроматографической подвижности показало, что выделенное соединение имеет другое значение Rf около 0,45. Обнаружено, что нарциссин и рутин имеют близкие спектральные характеристики [6, 7]. На наш взгляд, это объясняет ошибочный поход к анализу сырья календулы, применяемый в зарубежных фармакопеях, в которых ученые указывают на наличие рутина как диагностического вещества цветков ноготков.
Достоверно известно, что широкий спектр фармакологического действия цветков календулы (противовоспалительное, регенерирующее, антимикробное) обусловлен содержанием различных классов биологически активных соединений (БАС), таких как каротиноиды, флавоноиды (гликозиды кемпферола, кверцетина и изорамнетина), сапонины [5]. На наш взгляд, оптимальный подход к стандартизации цветков календулы должен включать в себя анализ сырья на содержание ведущих групп биологически активных веществ [8]. В этой связи нами ранее были разработаны методики качественного и количественного анализа цветков ноготков на содержание флавоноидов с использованием метода ТСХ и спектрофотометрии [7]. Этот подход был взят позже за основу и другими отечественными учеными [9]. Таким образом, анализ литературных данных показывает противоречивость подходов к анализу цветков и препаратов календулы лекарственной, которые ориентированы на различные группы БАС (флавоноиды, фенилпропаноиды, сапонины, каротиноиды, органические кислоты), что не позволяет объективно оценивать качество сырья и лекарственных средств данного растения. Следовательно, на настоящий момент разработка методик стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной с использованием современных методов анализа, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), представляется актуальным вопросом.
Целью нашего исследования является научное обоснование подходов к стандартизации цветков календулы лекарственной и препаратов на основе данного сырья методом ТСХ, спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись цветки календулы лекарственной, заготовленные в августе 2013 г. на фармакопейном участке Ботанического сада Самарского государственного университета, а также промышленные образцы сырья.
В работе были использованы тонкослойная хроматография, спектрофотометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография. Регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Воздушно-сухое растительное сырье подвергали исчерпывающему экстрагированию спиртом этиловым 70% в соотношении «сырье:экстрагент» — 1:30. Анализ полученных водно-спиртовых извлечений осуществляли с помощью ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе «хлороформ — метанол — вода» (26:14:3). Использовались стандартные образцы нарциссина (3-O-рутинозид изорамнетина), рутина (3-О-рутинозид кверцетина), кверцетина, изокверцитрина и астрагалина. ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе «Biotronic».
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты сравнительного исследования методом ТСХ свидетельствуют о том, что на хроматограммах водно-спиртовых извлечений цветков календулы доминирующим компонентом является нарциссин (3-O-рутинозид изорамнетина), который при проявлении хроматограммы свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты обнаруживается в виде доминирующего пятна желто-оранжевого цвета с Rf около 0,45. Данное диагностическое вещество было впервые выделено из данного растения методом колоночной хроматографии. Методом 1Н-ЯМР и масс-спектрометрии ранее было установлено химическое строение [6]. Сравнение выделенного нарциссина с ГСО рутином методом ТСХ (Rf около 0,4) по хроматографической подвижности показало, что полученное нами соединение имеет значение Rf около 0,45. Нарциссин по отношению к пятну ГСО рутина имеет значение Rs около 1,1. Ввиду сопоставимой подвижности и близких значений Rf и спектральных характеристик зарубежные ученые принимают пятно нарциссина за рутин (рис. 1), что находит отражение в ошибочных методиках анализа, включенных в Европейскую фармакопею и в фармакопеи других стран [1, 3, 9]. Расчет величины Rs позволит повысить объективность методики для анализируемого вещества. Кроме того, в этих же хроматографических условиях обнаруживается второе менее интенсивное пятно вещества желтого цвета с Rf около 0,6, который соответствует изокверцитрину.
Результаты сравнительного исследования электронных спектров водно-спиртовых извлечений образцов цветков календулы лекарственной свидетельствуют о том, что для всех образцов сырья характерны максимумы поглощения при λmax 260±2 нм (флавоноиды) и области 330–350 нм (флавоноиды и гидроксикоричные кислоты) (рис. 2). Кроме того, для раствора извлечения в присутствии AlClз наблюдается батохромный сдвиг в области 408 нм±2 нм (рис. 3), характерный для флавонолов с гликозилированной 3-ОН-группой. Важно отметить, что нарциссин и рутин, являющиеся 3-О-рутинозидами изорамнетина и кверцетина соответственно (рис. 1), близки по своим спектральным характеристикам – по коротковолновому и длинноволновому максимуму поглощения (около 258 нм и 360 нм) (рис. 4 и 5). Это нашло подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии: максимум поглощения в области 408–412 нм, что позволяет рекомендовать в качестве аналитической длины волны значение 412 нм.
Нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина) желтые кристаллы из этилового спирта, С28Н32О16, т. пл. 173-175ºС
Рутин (3-О-рутинозид кверцетина) желтый кристаллический порошок C27H30O16, т. пл. 192-196ºС.
Рис.1. Химические структуры важнейших флавоноидов цветков календулы лекарственной
Данное обстоятельство позволило использовать спектрофотометрию для количественного определения флавоноидов в пересчете на ГСО рутин.
В последнее время для целей стандартизации активно внедряется метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно осуществлять качественный и количественный анализ ЛРС. На наш взгляд, в условиях ВЭЖХ в качестве маркера может выступать доминирующий флавоноид нарциссин. Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования нарциссин хорошо отделяется от других компонентов цветков календулы лекарственной, что позволяет данный метод рекомендовать как для целей идентификации сырья ноготков, так и для целей стандартизации препаратов на основе сырья данного растения.
Определено, что содержание доминирующего соединения (нарциссина) в извлечении цветков календулы лекарственной, установленное методом ВЭЖХ, варьирует от 0,57±0,02% до 0,72±0,03%. В данных условиях в анализируемом извлечении также отмечается наличие флавоноида рутина в достаточном количестве (его содержание составляет 0,21%±0,01%). Кроме того, в минорных количествах обнаруживаются изокверцитрин (0,06%±0,002%) и кверцетин (0,04%±0,001%).
Рис. 2. УФ-спектры растворов водно-спиртовых извлечений из цветков календулы лекарственной. Обозначения: 1 – раствор извлечения (1:30); 2 — раствор извлечения (1:30) с добавлением алюминия хлорида
Рис. 3. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечений из цветков календулы лекарственной (дифференциальный спектр)
Рис. 4. УФ-спектр раствора нарциссина
Обозначения: 1 – исходный раствор; 2 — раствор с добавлением алюминия хлорида
Рис. 5. УФ-спектр раствора рутина
Обозначения: 1 – исходный раствор; 2 — раствор с добавлением алюминия хлорида
Таким образом, в ходе исследования разработана методика количественного определения доминирующего флавоноида нарциссина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Содержание нарциссина в цветках календулы, установленное с использованием данной методики, варьирует от 0,57±0,02% до 0,72±0,03%.
Учитывая специфичность нарциссина для цветков календулы лекарственной, считаем целесообразным использование метода ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение.
Необходимо отметить, что в зарубежных фармакопеях отсутствует опыт использования ВЭЖХ анализа для стандартизации сырья календулы [1, 3, 9, 10]. Важно подчеркнуть, что в современной литературе встречаются данные относительно возможности применения метода ВЭЖХ анализа для стандартизации сырья календулы [4, 8]. По данным некоторых авторов, анализ извлечения цветков календулы лекарственной методом ВЭЖХ необходимо проводить идентификацией кверцетина с определением высоты пика в данного вещества, а также с использованием ГСО кверцетина [8]. Кроме того, кверцетин не является диагностическим веществом для цветков календулы лекарственной, так как, во-первых, содержится в следовых количествах, а во-вторых, является наиболее распространенным флавоноидным агликоном в растениях. Другие исследователи в рамках проведения ВЭЖХ-анализа предлагают использовать такие маркерные компоненты, как: тифанеозид (изорамнетин-3-О-α-L-рамнопиранозил-(1→2)-α-L-рамнопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозид), нарциссин, изорамнетин-3-О-глюкозид и изорамнетин-3-О-(6’’-ацетил)-глюкозид [4]. Однако, несмотря на четкое хроматографическое разделение компонентов извлечения из цветков ноготков, представляются некорректными рассуждения ученых относительно доминирующего компонента — тифанеозида (производное изорамнетина). В опубликованных результатах высокоэффективной жидкостной хроматографии авторы не предлагают конкретное диагностическое соединение, не проводят расчет содержания доминирующего флавоноида, а также не приводят методику количественного определения [4]. Минорные количества рутина на хроматограмме не согласуются с данными наших исследований, а также с представлениями, изложенными в Европейской и Британской фармакопеях [9]. Европейские специалисты указывают на наличие рутина как диагностического вещества и в связи с близостью спектральных и физико-химических характеристик рутина с нарциссином не обнаруживают последнее в календуле лекарственной. На наш взгляд, доминирующим и диагностическим флавоноидом является нарциссин, и определение именно данного флавоноида, в том числе с использованием метода ТСХ и ВЭЖХ, является целесообразным для целей стандартизации сырья и препаратов.
Выводы:
1. Разработаны новые подходы к стандартизации подхода к стандартизации цветков календулы лекарственной, заключающиеся в комплексном использовании спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.
2. Учитывая специфичность нарциссина для цветков календулы лекарственной, считаем целесообразным использование метода ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение.
3. Разработанные подходы целесообразно использовать для целей стандартизации препаратов на основе цветков календулы лекарственной как возможность реализации принципа гармонизации в ряду «лекарственное растительное сырье — лекарственный препарат».
Рецензенты:
Шаталаев И.Ф., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара;
Правдивцева О.Е., д.фарм.н., доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара.
Библиографическая ссылка
Куркина А.В., Афанасьева П.В., Куркин В.А., Платонов И.А., Павлова Л.В. ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21546 (дата обращения: 21.11.2024).