Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

РОЛЬ ИНСУЛЯРНЫХ И КОНТРИНСУЛЯРНЫХ ГОРМОНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ АЛЛОКСАНОВОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Михайличенко В.Ю. 1 Столяров С.С. 1
1 Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Министерства образования и науки Российской Федерации
Сахарный диабет – группа метаболических нарушений, которые характеризуются синдромом хронической гипергликемии вследствие нарушения секреции эндогенного инсулина в поджелудочной железе и/или ограничения его действия на периферии. В патогенезе сахарного диабета 1 типа помимо недостатка инсулина важную роль играют контринсулярные гормоны. Первоначально при нормальных показателях инсулина и С-пептида уровень кортикостерона находится на низком (нормальном) уровне, но при длительном пребывании инсулина и С-пептида на показателях ниже нормы, концентрация кортикостерона прогрессивно увеличивается, даже если инсулярные гормоны и остаются стабильные на низком уровне. Патологическая низкая концентрация инсулярных гормонов приводит к дисфункциональному патологическому росту уровня кортикостерона и уменьшению концентрации тироксина и трийодтиронина. При гистологическом исследовании через 1 месяц после начала эксперимента в поджелудочной железе животных при экспериментальном СД отмечалось резкое снижение числа островков Лангерганса, а сохранившиеся островки имели неправильную форму, небольшие размеры, состояли преимущественно из альфа-клеток.
инсулярные и контринсулярные гормоны
сахарный диабет
1. Дифференцировка стволовых и прогениторных β–клеток поджелудочной железы в инсулинсекретирующие клетки у мышей при сахарном диабете / Е.Г. Скурихин, Н.Н. Ермакова, Е.С. и др. // БЭБМ. – 2013. – № 5. – С.681-687.
2. Мельниченко Г.А. «Другие типы» диабета: контринсулярные гормоны и генетическая предрасположенность, новые возможности диагностики и лечения / Г.А. Мельниченко, И.В. Глинкина, Д.М. Суровцева // Вестник РАМН. – 2012. – № 1. – С.50-53.
3. Трансплантация культуры клеток поджелудочной железы при аллоксановом диабете (сообщение 1) / О.И. Миминошвили, В.Ю. Михайличенко, А.Г. Попандопуло и др. // Вестник неотложной и восстановительной медицины. – 2003. – Т.4. – № 3. – С.530-533.
4. Черкасова О.П. Адренокортикальная и ренин-ангиотензиновая системы в динамике экспериментального диабета / О.П. Черкасова, В.Г. Селятицкая // Биомедицинская химия. – 2013. – 59. – № 2. – С.183-191.
5. Черкасова О.П. Активность адренокортикальной системы при экспериментальном диабете у крыс / О.П. Черкасова, Н.В. Кузнецова, Н.А. Пальчикова, В.Г. Селятицкая // Сахарный диабет. – 2011. – № 2. – С.37-40.
Сахарный диабет (СД) - группа метаболических нарушений, которые характеризуются синдромом хронической гипергликемии вследствие нарушения секреции эндогенного инсулина в поджелудочной железе и/или ограничения его действия на периферии. В патогенезе сахарного диабета 1 типа помимо недостатка инсулина важную роль играют контринсулярные гормоны, которые блокируют действие инсулина на клеточном уровне, уменьшают его выработку в поджелудочной железе и ускоряют разрушение инсулина в печени под действием фермента инсулиназы (соматотропин, тироксин, трийодтиронин, глюкокортикоидные гормоны и андрогены) [5]. При СД усиливается продукция глюкокортикоидных гормонов, которые, индуцируя синтез ферментов глюконеогенеза, способствуют повышению синтеза глюкозы в печени. Это является компенсаторной реакцией на недостаток глюкозы в клетках в условиях гипоинсулинемии или инсулинорезистентности и приводит к утяжелению выраженности метаболических нарушений при сахарном диабете [2]. Вопрос о функциональной активности адренокортикоидной системы при диабете приобретает особое значение, когда экспериментальные модели СД-1 используются для изучения влияния стресса на поражение поджелудочной железы и печени химическими диабетогенами (аллоксаном, стрептозотоцид и др.), поскольку глюкокортикоидные гормоны играют ведущую роль в поддержании реактивности организма к внешним воздействиям. В связи с этим исследования отдельных звеньев патогенеза СД и его осложнений, проверки эффективности новых препаратов и способов лечения диабета в динамике развития заболевания, что определяется тесными взаимоотношениями инсулина и глюкокортикоидных гормонов в регуляции процессов метаболизма [1,3,4].

Целью работы было изучить роль инсулярных и контринсулярных гормонов в патогенезе развития аллоксанового сахарного диабета у крыс в эксперименте.

Материал и методы исследования. Экспериментальное исследование выполнено на 20 крысах самцах массой 200-250 г. Сахарный диабет вызывали путем подкожного введения раствора аллоксана тетрагидрата фирмы Fluka-Sigma (Германия) из расчета 20 мг на 100 г массы тела, предварительно 2 суток голодавшим животным. Содержание глюкозы, холестерина и триглицеридов определяли при помощи программируемого фотометра Eppendorf Epac 6140, используя соответствующие наборы реактивов производства «Диакон ДС» (Россия), «Diasys» (Германия), «LaChema» (Чехия). Соотношение фракций липопротеидов определяли электрофотометрическим методом с применением системы для электрофореза «Helena» (Франция), в качестве носителя использовались пленки из ацетата целлюлозы. Концентрацию глюкозы определяли глюкозоксидазным методом. Содержание холестерина исследовали ферментативным методом с холестеролоксидазой и пероксидазой. Определение концентрации триглицеридов проводилось ферментативным методом с глицерокиназой и глицерол-3-фосфатоксидазой. Определение содержания инсулина, кортикостерона, С-пептида, тироксина и трийодтиронина проводили радиоиммунологическим методом с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов фирмы "Immunotech" (Чехия). В опыт брали животных со средней тяжестью сахарного диабета (условно выделяли 3 степени тяжести течения сахарного диабета: легкая - концентрация глюкоза крови была в пределах 10 ммоль/л, средняя - 10-15 ммоль/л, тяжелая - 15 и более). Гистологическое исследование органов (ПЖ, сердца, почек, сосудов) проводили на 6, 10, 14 и 30 сутки после моделирования сахарного диабета. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по Вергоффу, альциановым синим при рН 1,0 и 2,6, выполняли ШИК-реакцию. Исследование окрашенных препаратов и морфометрическое исследование проводили с помощью исследовательского микроскопа Olympus AX70 (Япония) и соединенной с ним компьютерной системы с программой анализа изображения AnalySIS 3.1 (Германия).

Статистическую обработку полученных данных выполняли на компьютере Pentium III с помощью программ «Microsoft Excel 10.0», «Statistica 6.0» (USA).

Результаты и их обсуждение.  У крыс с моделью диабета через 3 месяца отмечался стабильный уровень глюкозы крови, который находился на уровне 12,1±0,49 ммоль/л и недостоверно увеличивался к 6 месяцу до уровня 13,21±1,83 ммоль/л, затем к 9 месяцу уровень глюкозы равнялся 19,08±2,37 ммоль/л, что достоверно отличалось от показателей 6 месяца. По сравнению с изначальным уровнем (1 месяца диабета), уровень глюкозы на 9 месяце болезни увеличился в 1,4 раза и достоверно отличался (t=2,21; p<0,05). Данный процесс сопровождался стабильным высоким уровнем гликозилированного гемоглобина, который до 6 месяца находился на уровне 5,59±0,41 %, а к 9 месяцу недостоверно (t=2,21; p<0,05) увеличивался до 6,21±0,54 %, что в 1,12 раз выше первоначального показателя. Животные в контрольной группе не жили более 9 месяцев и погибали от разных осложнений сахарного диабета.                                     

При изучении липидного обмена в сроках 1,3,6 и 9 месяцев отмечается недостоверное уменьшение ЛПВП, повышение ЛПНП, ЛПОНП, холестерина и триглицеридов в динамике (табл.1). Так в срок 9 месяцев концентрация ЛПВП недостоверно уменьшилась в 1,14 раза по сравнению с первоначальным значением, ЛПНП недостоверно увеличились в 1,1 раза, ЛПОНП также достоверно увеличились в 1,24 раза. На этом фоне уровень триглицеридов недостоверно увеличился до 1,34±0,06 ммоль/л, что в 1,24 раза выше первоначальных значений, а показатель холестерина недостоверно вырос в 1,04 раза. Таким образом, концентрация ЛПВП, ЛПНП, триглицеридов и холестерина статистически оставалась на одном уровне, а концентрация ЛПОНП повысилась. При этом ИА (индекс атерогенности) изменился с 5.27 до 6,42 (при норме - 2).

Таблица 1

Показатели липидного обмена у крыс с аллоксановым диабетом (M±m)

         Срок

Показатель

 

1 месяц

 

3 месяца

 

6 месяцев

 

9 месяцев

ЛПВП, (ммоль/л)

0,81±0,11*

0,76±0,21*

0,74±0,11*

0,71±0,11*,***

ЛПНП, (ммоль/л)

3,1±0,21*

3,28±0,12*

3,32±0,22*

3,45±0,21*,***

ЛПОНП, (ммоль/л)

1,08±0,09*

1,12±0,09*

1,21±0,08*

1,34±0,06*.**

Триглицериды, (ммоль/л)

2,11±0,11*

2,23±0,21*

2,22±0,11*

2,34±0,1*,***

Холестерин, (ммоль/л)

5,08±0,39*

5,12±0,26*

5,16±0,34*

5,27±0,26*,***

Примечания: * - различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); ** - различие между первоначальным и конечным показателем достоверно (р<0,05); *** - различие между первоначальным и конечным показателем недостоверно (р>0,05).

Одним из основных показателей эффективности лечения является стабилизация гормонального фона, когда происходит равновесие между инсулярными и контринсулярными гормонами. Как упоминалось выше, при сахарном диабете происходит гормональный дисбаланс, проявляющийся в понижении уровня инсулярных гормонов и повышении концентрации контринсулярных, а также в неадекватной их реакции на различные стрессорные факторы. В разные фазы развития аллоксанового диабета отмечалось соответствующее колебаниям уровня глюкозы крови, изменение концентрации инсулина, который в 1 фазу равнялся 0,76±0,02 мкМЕ/л, во 2 фазу - 27,41±1,25 мкМЕ/л и в 3 фазу - 2,32±0,04 мкМЕ/л.

С целью изучения динамики концентрации инсулярных и контринсулярных гормонов, нами были выбраны следующие виды гормонов: инсулин, С-пептид - представители инсулярных гормонов, кортикостерон, тироксин и трийодтиронин - представители контринсулярных гормонов. Половые гормоны не брали во внимание, т.к. у крыс 5-7 дневный половой цикл и их динамика не отражают сути изменений, протекающих в организме.

Таблица 2

Уровни инсулярных и контринсулярных гормонов при аллоксановом диабете у крыс в срок до 1 месяца (M±m)

Показатель

Норма

3 сутки

7 сутки

14 суток

1 месяц

Инсулин,  мкМЕ/л

3,53±0,21

2,34±0,02 ****

2,05±0,04 ****

2,07±0,01 **

1,94±0,1 ***

C-пептид, нг/мл

0,733±0,02

0,231±0,015 ****

0,175±0,002 ****

0,173±0,001 **

 

0,152±0,01*, #

Кортикостерон, нмоль/л

355,22±25,2

513,69±11,73 ****

597,72±13,26 ****

597,93±11,1 **

 

609,3±20,7 **, #

Тироксин, нмоль/л

39,54±1,93

27,91±1,4 ****

22,46±0,97*

22,51±0,83**

 

20,12±0,82**, #

Трийодтиронин, нмоль/л

2,42±0,15

1,75±0,12 ****

1,22±0,02 *

1,24±0,03 **

 

1,08±0,09 **,#

Примечания: * - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05); ** - различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); *** - различие между первоначальным и конечным показателем недостоверно (р<0,05); **** - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,001); # - различие между первоначальным и конечным показателем достоверно (р<0,05).

После окончания моделирования аллоксанового диабета концентрация инсулина (Табл. 2) на 3 сутки равнялась 2,34±0,02 мкМЕ/л, что в 1,5 раз ниже нормы при Р<0,001. Далее показатель инсулина статистически достоверно уменьшался и к 7 суткам равнялся 2,05±0,04 мкМЕ/л и оставался на этом уровне до 14 суток. Затем достоверно наступала вторая волна падения уровня инсулина, и к 1 месяцу его концентрация равнялась 1,94±0,1 мкМЕ/л, что в 1,82 раза ниже нормы при Р<0,001. Концентрация С-пептида к 3 суткам уменьшилась в 3,17 раза при Р<0,001 и равнялась 0,231±0,015 нг/мл. Далее она не изменялась до 14 суток и к концу 1 месяца достоверно понижалась в 1,14 раза и равнялась 0,152±0,01 нг/мл, что в 4,8 раз меньше исходного уровня при Р<0,001. Причем существует четкая линейная зависимость между концентрацией инсулина и С-пептида при χ=0,99 и зависимость подчиняется линейной регрессии, которую можно представить в виде С= 1,65+2,63*И, где С - С-пептид, И - инсулин при F = 156,32,  RI = 0,987, р<0,006, где F -критерий Фишера, RI - степень точности описания модели процесса, р - уровень значимости критерия Фишера.

Уровень кортикостерона к 1 суткам повысился в 1,45 раз по сравнению с исходным при Р<0,001 и равнялся 513,69±11,73 нмоль/л. Затем он постепенно повышался и к 7 суткам равнялся 597,72±13,21 нмоль/л и до 14 суток статистически достоверно оставался на этом уровне, что в 1,68 раз выше исходного значения при Р<0,001. Далее к 1 месяцу концентрация кортикостерона достоверно повысилась до 609,3±20,7 нмоль/л, что в 1,72 раз выше нормы при Р<0,001.

Между уровнем кортикостерона и инсулина существует линейная зависимость χ=0,99 и она подчиняется линейной регрессии: И = 5,66 - 0,02·К/3 где К - кортикостерон, И - инсулин при F = 92,388,  RI = 0,97, р<0,011. Между концентрацией С-пептида и кортикостерона также существует линейная регрессия χ=0,97, и зависимость можно представить в виде формулы линейной регрессии: С = 1,5-0,0068·К/3, при F = 29,67,  RI = 0,94, р<0,03.

Концентрация тироксина на 3 сутки уменьшается в 1,42 раза по сравнению с исходным уровнем при р<0,05 и продолжает статистически достоверно снижаться до 7 суток и равняется 22,46±0,97 нмоль/л и остается на этом уровне до 14 суток.  В 1 месяц показатель равняется 20,12±0,82 нмоль/л, что недостоверно отличается от данных за 14 сутки, что в 1,96 раз меньше исходных данных при р<0,05. Уровень трийодтиронина к 3 суткам уменьшился в 1,38 раза по сравнению с исходными данными при Р<0,001, затем к 7 суткам он понижался до 1,22±0,02 нмоль/л и статистически достоверно не изменялся до 1 месяца. В 1 месяц он равнялся 1,08±0,09 нмоль/л, что в 2,24 раза ниже первоначального уровня при Р<0,001.

В отдаленные сроки (табл. 3) уровень инсулина до 3 месяца остается достоверно неизмененным и к 6 месяцу уменьшается до 1,84±0,023 мкМЕ/л при Р<0,001, что в 1,94 раза меньше нормы при Р<0,001 и статистически достоверно не отличается от 1 месячного показателя. Концентрация С-пептида статистически достоверно остается на стабильном низком уровне и к концу 9 месяца равняется 0,148±0,015 нг/мл при р<0,05, что в 4,95 раз достоверно ниже нормы. Уровень кортикостерона также оставался стабильным до конца опыта и равнялся к 9 месяцу 642,9±25,8 нмоль/л, что в 1,81 раза достоверно выше нормы. Концентрация тироксина аналогично оставалась стабильной и к 9 месяцу составляла 16,41±0,51 нмоль/л, что в 2,41 раза ниже нормы. Показатель трийодтиронина к 3 месяцу достоверно уменьшился до 0,57±0,04 нмоль/л, т.е. в 2,08 раз по сравнению с предстоящим показателем, что в 4,65 раза меньше нормы при  Р<0,001.

Таблица 3

Уровни инсулярных и контринсулярных гормонов при аллоксановом диабете у крыс в срок до 1 года (M±m)

Показатель

Норма

1 месяц

3 месяца

6 месяца

9 месяцев

Инсулин,  мкМЕ/л

3,53±0,21

1,94±0,1

 

1,9±0,1 **

1,84±0,02 ****

1,83±0,04 **, ***

C-пептид, нг/мл

0,733±0,02

0,152±0,01

 

0,154±0,025 **

0,15±0,03 **

0,148±0,015**, #

Кортикостерон, нмоль/л

355,2±25,2

609,3±20,7

 

613,5±17,4 **

622,2±22,2**

642,9±25,8 **, #

Тироксин, нмоль/л

39,54±1,93

20,12±0,82

 

18,7±0,94 **

17,6±0,67 **

16,4±0,51 **, #

Трийодтиронин, нмоль/л

2,42±0,15

1,08±0,09

 

0,57±0,04*

0,52±0,02 **

0,51±0,03 **, ****

Примечания:* - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05); ** -  различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); *** - различие между первоначальным и конечным показателем недостоверно (р<0,05); **** - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,001); # - различие между первоначальным и конечным показателем достоверно (р<0,05).

В результате проведенного морфологического исследования установлено, что при экспериментальном аллоксановом диабете на третий день наблюдается резкое уменьшение количества клеток в островках Лангерганса. Так как воздействие аллоксана приводит к активации в В-клетках островков поджелудочной железы процессов перекисного окисления липидов, то в них активируется генетическая программа самоуничтожения, т.е. происходит их апоптоз. Нами также не было обнаружено признаков некроза островковых клеток и фиброза на месте погибших островков. Также в пользу апоптоза говорит и отсутствие клеточной реакции на гибель клеток островкового аппарата. Также можно объяснить и апоптоз А-клеток и расположенных рядом с островком экзокринных и протоковых эпителиоцитов. Так как при апоптозе образовавшиеся апоптотические тельца, окруженные цитоплазматической мембраной, в которых происходит скопление свободных радикалов, захватываются соседними клетками, то и в них тоже происходит активация апоптоза. Данный процесс приводит к исчезновению большого количества островков, от которых не остается никаких следов. В сохранившихся островках остается не более 7 клеток, скорее всего это недифференцированные клетки, которые не участвуют в процессе поглощения апоптотических телец. В результате действия аллоксана к 30 дню удельный объем островков снижается в 14,3 раза по сравнению с нормой.

Развивающаяся при массивной гибели В-клеток гипоинсулинемия приводит к нарушению усвоения клетками глюкозы и дистрофическим изменениям, особенно в артериальных сосудах, что проявляется мукоидным и фибриноидным набуханием в их стенке, повышением проницаемости с развитием периваскулярных плазморрагий. Уже к 30 дню развивается выраженная диабетическая микроангиопатия, которая проявляется утолщением стенок сосудов всех органов за счет набухания и иногда гиалиноза, в совокупности с нарушениями гемостаза в них формируются гиалиновые тромбы. Микроангиопатия приводит к усугублению дистрофических изменений в различных органах. В почках кроме вакуольной дистрофии наблюдается накопление гликогена в извитых канальцах, что связано с активацией процессов реабсорбции глюкозы из мочи. В сердце развивается гипертрофия миокарда, которая может быть связана с развитием гипертензии у животных, и мелкие очаги дистрофических изменений кардиомиоцитов.

Выводы. Таким образом, введение аллоксана приводит к повреждению эндокринной части поджелудочной железы, что сопровождается понижением концентрации инсулина и С-пептида, а также патологическим повышением уровня кортикостерона, который усугубляет течение диабета у животных. Гормональный дисбаланс выражается в виде повышения концентрации глюкозы крови и гликозилированного гемоглобина. Данный процесс сопровождается нарушением липидного обмена, что приводит к повышению атерогенности крови и соответственно приводит к развитию диабетической ангиопатии. Декомпенсация течения диабета приводит к тому, что у животных к 9 месяцу развивается весь спектр поздних диабетических осложнений, которые приводят к смерти животных.

Рецензенты:

Кубышкин А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патофизиологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Симферополь;

Ильченко Ф.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой  хирургии № 2 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Симферополь.


Библиографическая ссылка

Михайличенко В.Ю., Столяров С.С. РОЛЬ ИНСУЛЯРНЫХ И КОНТРИНСУЛЯРНЫХ ГОРМОНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ АЛЛОКСАНОВОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 4. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21235 (дата обращения: 29.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074