Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ЭКСПРЕССИЯ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ 9 И ЕЁ ТКАНЕВОГО ИНГИБИТОРА В СОСУДАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ТАБАКОКУРЕНИЯ

Захарчук Н.В. 1 Невзорова В.А. 1 Гончар Е.Ю. 1 Мокшина М.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет Минздрава России»
Изучено содержание матриксной металлопротеиназы-9 и ее тканевого ингибитора в условиях экспериментального моделирования табакокурения. Исследование проведено на крысах-самцах линии Vistar, разделенных на две группы. Контрольная группа животных дышала атмосферным воздухом, а экспериментальную группу ежедневно обкуривали табачным дымом в ингаляционной камере в течение 6 месяцев согласно протоколу H. Zheng и колл. После декапитации животных изготавливались гистологические препараты головного мозга. Исследована экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 (ММP-9) и ее тканевого ингибитора (TIMP-1) в церебральных артериях и нейроглии. Для оценки активности данных маркеров использован метод иммунопероксидазной реакции с моно- и поликлональными антителами против МMP-9 и TIMP-1, также использованы вторичные антитела, меченые пероксидазой хрена. Количественную оценку ферментативной активности определяли, измеряя плотность преципитата гистохимической реакции в единицах оптической плотности (ЕОП). У животных экспериментальной группы установлено повышение экспрессии ММР-9 как в сосудистой стенке церебральных артерий, так и в капиллярах и межклеточном пространстве нейроглии, что может быть связано с системным соединительно-тканным дисбалансом при длительном воздействии табачного дыма. Одновременно с этим отмечено усиление экспрессии TIMP-1, очевидно, вследствие компенсаторной реакции, направленной на подавление стимулированной активности MMP-9.
крысы
нейроглия
головной мозг
металлопротеиназы
табакокурение
1. Castellanos M. Plasma metalloproteinase-9 concentration predicts hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Castellanos M., Leira R., Serena J., Pumar J.M., Lizasoain I., Castillo J. et al. Stroke. — 2003. Vol. 34. — Р. 40–46.
2. Circu M.L. Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis. Circu M.L., Aw T.Y. Free Radic. Biol. Med. — 2010. Vol. 48. – P. 749–762.
3. Hongao Zheng. Development and characterization of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) induced by sidestream cigarette smoke. Hongao Zheng, Yuening Liu, Tian Huang et al. Toxicology Letters. – 2009. Vol. 189. – P. 225–234.
4. Johnson C. Matrix metalloproteinase-2 and -9 differentially regulate smooth muscle cell migration and cell-mediated collagen organization. Johnson C., Galis Z.S. Arterioscler., Thromb. Vasc. Biol. – 2004. – Vol. 24. P. 54–60.
5. Lukes A. Extracellular matrix degradation by metalloproteinases and central nervous system diseases. Lukes A., Mun-Bryce S., Lukes M. et al. Mol. Neurobiol. — 1999. V. 19. P. 267–284.
6. Mazzone Р. Pathophysiological Impact of Cigarette Smoke Exposure on the Cerebrovascular System with a Focus on the Blood-brain Barrier: Expanding the Awareness of Smoking Toxicity in an Underappreciated Area. Mazzone Р., Tierney W., Hossain M. et al. Int. J. Environ. Res. Public Health. – 2010. – Vol. 7. P. 4111–4126.
7. Moro M.A. The Prediction of Malignant Cerebral Infarction by Molecular Brain Barrier Disruption Markers. Moro M.A., Leira R., Lizasoain I., Jose Castillo et al. Stroke. — 2005. — Vol. 36. — P. 1921–1926.
8. Rajagopalan S. Reactive oxygen species produced by macrophagederived foam cells regulate the activity of vascular matrix metalloproteinases in vitro: implications for atherosclerotic plaque stability. Rajagopalan S., Meng X.P., Ramasamy S. et al. J. Clin. Invest. — 1996. V. 98. P. 2572–2579.
9. Shinton R. Meta-analysis of relation between cigarette smoking and stroke. Shinton R., Beevers G. BMY 1989. Vol. 298. P. 789–94.
10. Xia M. Stimulus specificity of matrix metalloproteinase dependence of human Т cell migration through a model basement membrane. Xia M., Leppert D., Hauser S.L. et al. J Immunol. – 1996. Vol. 156. P. 160–167.

Курение является одним из наиболее значимых факторов риска развития сердечно-сосудистых, бронхолегочных и онкологических заболеваний. Никотинассоциированные болезни занимают лидирующие позиции в структуре смертности цивилизованного общества. Тем не менее механизмы и последствия действия продуктов сгорания табака являются не до конца изученными. Метаанализ 22 исследований, посвященных изучению связи между курением и риском развития ишемического инсульта, показал, что при хроническом табакокурении происходит удвоение относительного риска развития ишемического инсульта [9]. Можно предположить наличие объединяющего механизма развития системной сосудистой дисфункции при хроническом табакокурении, в том числе ответственного за повреждение сосудов головного мозга. При этом нарушение церебрального кровотока происходит при срыве механизмов его ауторегуляции вследствие повреждения морфологической целостности эндотелиальной выстилки и разрушения межклеточного матрикса в сосудистой стенке. В ряде экспериментальных работ подтверждено, что агрессивные поллютанты табачного дыма (бензопирен, пероксинитрит, акролеин, цианиды, пероксиды и др.) способны прямо повреждать эндотелиоциты за счет экспрессии на их поверхности молекул адгезии и интенсификации процессов перекисного окисления липидов. В свою очередь окисленные липопротеиды в интиме сосуда играют роль аттрактантов для хемотаксиса лейкоцитов и моноцитов, которые начинают продуцировать в большом количестве провоспалительные цитокины ИЛ-1, 6, TNF-α [2]. Итогом этих процессов становятся запуск системного воспалительного ответа и дезорганизация гладкомышечного каркаса артерий.

В последние годы в экспериментальных исследованиях, направленных на раскрытие механизмов гипоксических повреждений гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), изучаются матриксные металлопротеиназы (MMP) — семейство ферментов, разрушающих белки внеклеточного матрикса. Установлено, что MMP играют важную роль в ряде физиологических и патологических процессов, включая эмбриогенез, заживление ран, воспаление, сердечно-сосудистые болезни, болезни легких и рак. Один из ферментов этого семейства ММР-9 разрушает коллаген IV типа, который является главным компонентом базальной мембраны церебрального эндотелия, и, следовательно, создает условия для миграции клеток через ГЭБ [5].

Целью нашего исследования явилось изучение длительного воздействия табачного дыма на экспрессию матриксной металлопротеиназы ММР-9 и ее тканевого ингибитора TIMP-1 в головном мозге при экспериментальном моделировании хронического табакокурения.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели нами была воспроизведена экспериментальная модель длительного табакокурения in vivo у крыс в соответствии с протоколом H. Zheng и колл. [3]. Материалом исследования послужили крысы-самцы линии Вистар 8-недельного возраста, разделенные произвольно на 2 группы. Контрольная группа дышала атмосферным воздухом, а животных экспериментальной группы обкуривали табачным дымом в специальной камере для ингаляций в течение 1 ч утром и 1 ч днем ежедневно в течение 6 месяцев. Для ингаляции использованы коммерческие нефильтрованные сигареты (торговая марка Прима, Россия), содержащие 16 мг смолы и 1,2 мг никотина в одной сигарете. Эксперименты проводились в соответствии с Хельсинской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом от 2008 г. Через 6 месяцев после ингаляции табачного дыма животных фиксировали и анестезировали путем внутрибрюшинного введения рометара (Xylazinum, «Spora», Praha) в концентрации 5,5 мг/кг. Затем производилась декапитация животных и изготавливались гистологические препараты головного мозга. Для оценки локализации и экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 (ММP-9) и ее тканевого ингибитора (TIMP-1) использовался непрямой иммуногистохимический метод. Была проведена иммунопероксидазная реакция с моно- и поликлональными антителами против МMP-9 и TIMP-1, а в качестве вторичных антител использованы антитела, помеченные пероксидазой хрена. Количественную оценку степени экспрессии МMP-9 и TIMP-1 проводили путем измерения суммарной плотности преципитата иммуногистохимической реакции, результат выражали в единицах оптической плотности (ЕОП). Гистологические препараты головного мозга просматривали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата AxioCam ICc3 (Carl Zeiss, Германия). Обработку результатов осуществляли с помощью программ Adobe Photoshop 7.0 и Image J. Достоверность различий между группами (при p<0,05) оценивали с помощью коэффициента Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Нам представилось интересным изучить содержание MMP-9 и TIMP-1 в различных структурах головного мозга, а именно в церебральных сосудах и нейроглии.

ММР-9 относится к коллагеназам IV типа и является протеолитическим ферментом, способным денатурировать фибриллярные коллагены и поддерживать баланс в составе экстрацеллюлярного матрикса за счет участия в деградации эластина, фибронектина и коллагена IV типа, главного компонента базальных мембран. [4].

Согласно полученным результатам ММР-9 локализуется как в сосудистой стенке, так и в нейроглии. При этом установлено достоверное повышение гистохимической активности ММР-9 в церебральных артериях у животных экспериментальной группы по сравнению с контролем (17,98 ЕОП и 11,07 ЕОП соответственно при р<0,05) (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессия MMP-9 и TIMP-1 в церебральных сосудах и нейроглии

Полученные результаты могут свидетельствовать об участии ММР-9 в ремоделировании сосудистой стенки церебральных артерий за счет деградации коллагена и нарушении межклеточного матрикса. Одним из механизмов повышения экспрессии MMP-9 в данном случае может быть оксидативный стресс, вызванный накоплением свободно-радикальных форм кислорода при длительном воздействии табачного дыма [6]. Активные формы кислорода не только вызывают свободно-радикальное окисление биомолекул, но и являются регуляторами активности ряда ферментов, включая матриксные металлопротеиназы, а через окисление специфических тиольных групп белков могут изменять конформацию белковых факторов транскрипции, что приводит к их активации или ингибированию. Так, прямое активирующее действие активных форм кислорода на матриксные металлопротеиназы наблюдалось при инкубации очищенных предшественников внеклеточных матриксных металлопротеиназ про-ММР-2 и про-ММР-9 гладких миоцитов человека с системой ксантин — ксантиноксидаза [8].

Нами также обнаружено, что у крыс экспериментальной группы содержание MMP-9 повышено не только в церебральных сосудах, но и в капиллярах и межклеточном веществе нейроглии (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия ММР-9 в головном мозге крыс контрольной группы (Б) и у животных с моделью табакокурения (А), ув.х20. Стрелками указана локализация маркера к ММР-9 в межклеточном пространстве нейроглии и капиллярах

При этом в группе курения отмечено двукратное превышение MMP-9 по сравнению с контролем (11,34 ЕОП и 5,78 ЕОП соответственно при р<0,05) (рис. 1). По-видимому, это связано с тем, что MMP-9 является протеолитическим ферментом, с помощью которого лимфоциты повреждают базальную мембрану ГЭБ и проникают в ткань мозга [10]. Так, в ряде экспериментальных работ показано, что MMP-9 является молекулярным маркером прорыва ГЭБ у пациентов с инсультом. При этом в плазме крови его в два раза больше, чем у здоровых людей [7]. В других работах показано, что повышение MMP-9 в сыворотке крови также ассоциировано с разрушением ГЭБ в остром периоде ишемического инсульта [1].

В свою очередь изменять и контролировать активность матриксных металлопротеиназ могут их эндогенные регуляторы и специфические тканевые ингибиторы (TIMP). ТIМP различаются по их специфическому действию на ММP. Так, например, TIMP-1 значительно лучше ингибирует MMP-9, в то время как TIMP-2 подавляет активность MMP-2.

Одновременно с увеличением экспрессии MMP-9 нами зарегистрировано повышение плотности преципитата TIMP-1 как в сосудах головного мозга, так и в нейроглии у животных экспериментальной группы. Так, содержание TIMP-1 в сосудах и нейроглии при табакокурении составило 8,11 ЕОП и 4,31 ЕОП соответственно, что достоверно отличалось от группы контроля — 7,05 ЕОП и 2,45 ЕОП соответственно при р<0,05 (рис. 1). ТIMP-1 является одним из главных эндогенных ингибиторов ММР-9 в тканях и имеет центральную функцию в поддержании этого баланса.

Заключение

Установленный в нашем исследовании факт повышенной экспрессии ММР-9 свидетельствует о нарушении процессов деградации коллагена как в сосудистой стенке церебральных артерий, так и в капиллярах и межклеточном пространстве нейроглии и отражает системный характер соединительно-тканного дисбаланса при длительном воздействии табачного дыма. Выявленное одновременно с этим повышение TIMP-1 может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на подавление стимулированной активности MMP-9.

Рецензенты:

Соляник Е.В., д.м.н., профессор кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России , г. Владивосток;

Суровенко Т.Н., д.м.н., профессор кафедры госпитальной педиатрии ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, г. Владивосток.


Библиографическая ссылка

Захарчук Н.В., Невзорова В.А., Гончар Е.Ю., Мокшина М.В. ЭКСПРЕССИЯ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ 9 И ЕЁ ТКАНЕВОГО ИНГИБИТОРА В СОСУДАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ТАБАКОКУРЕНИЯ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 4. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21063 (дата обращения: 20.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074