Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Кит О.И. 1 Франциянц Е.М. 1 Димитриади С.Н. 1 Каплиева И.В. 1 Трепитаки Л.К. 1 Черярина Н.Д. 1 Ткаля Л.Д. 1

---

1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России

Исследовано влияние новокаиновой паранефральной блокады на уровень образования продуктов перекисного окисления липидов. В гомогенатах тканей коркового слоя правой (ишемизированной) и левой (контралатеральной) почек белых беспородных крыс разного возраста и пола были изучены уровни содержания малонового диальдегида и диеновых конъюгатов. Для определения эффективности образования вторичных продуктов ПОЛ был рассчитан коэффициент ДК/МДА. Определение проводили в динамике восстановления кровотока (1 ч, 3 ч и 48 ч) и после проведения паранефральной блокады (1 ч и 48 ч). Выявлено, что наиболее устойчивыми к патологическому действию ишемии-реперфузии оказались молодые самки и старые самцы. Предварительное проведение новокаиновой блокады приводило к стойкому одинаковому повышению уровня ДК и снижению уровня МДА в обеих почках в динамике восстановления кровотока, нормализации коэффициента ДК/МДА в корковом веществе левой контралатеральной почки обеих групп животных во все исследуемые сроки и увеличению показателя относительно значений у животных без блокады в правой ишемизированной почке.

Статья в формате PDF

147 KB

ДК

МДА

паранефральная блокада

1. Бизенкова М.Н. Общие закономерности метаболических расстройств при гипоксии различного генеза и патогенетическое обоснование принципов их медикаментозной коррекции: диссертация ... кандидата медицинских наук, Саратов, 2008.

2. Казимирко В.К., Иваницкая Л.Н., Крутовой В.В., Дубкова А.Г., Силантьева Т.С. Перекисное окисление липидов противоречие, проблемы // Украинский ревматологический журнал, 2014. — № 3 (57). — С. 13–17.

3. Костюк В.А., Потапович А.И., Лунец Е.Ф. Спектрофотометрическое определение диеновых конъюгатов // Вопросы мед. химии. 1984. № 4. С. 125–127.

4. Макаренко B.C., Жизневская Н.Г., Колтыгина Т.Н. и др. Интенсивность перекисного окисления липидов в почках при нефротоксической острой почечной недостаточности // Урология. 2000. — № 1. — С. 26–29.

5. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977. С. 392.

6. Симион А.Ю. Макеева А.В., Лидохова О.В Сравнительная оценка образования первичных продуктов ПОЛ при ишемическом повреждении различных тканей // http://www.scienceforum.ru/2015/895/7820

7. Тарасов Н.И., Тепляков А. Т., Малахович Е.В. и др. Состояние перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты крови у больных инфарктом миокарда, отягощенным недостаточностью кровообращения // Тер.архив. 2002. № 12. C. 12–15.

8. Ahmadiasi N., Banaei S., Alihemmati A. Combination Antioxidant Effect of Erythropoietin and Melatonin on Renal Ischemia-Reperfusion Injury in Rats // Iran J. Basic Med. Sci. – 2013. – Vol. 16, № 12. – P. 1209–1216.

9. Hueper K., Gutberlet M., Rong S., Hartung D., Mengel M., Lu X., Haller H., Wacker F., Meier M., Gueler F. Acute kidney injury: arterial spin labeling to monitor renal perfusion impairment in mice-comparison with histopathologic results and renal function // Radiology. – 2014. – Vol. 270, № 1. – P. 117–24.

10. Pavlick K.P., Laroux F.S., Fuseler. et.al. Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease// Free Radical Biol. Med., 2002 . — Vol. 33. № 3. — P. 311–322.

11. Stadtman E.R., Levine R.L.. Chemical modification of proteins by reactive oxygen species. In: Dalle-Donne I., Scaloni A., Butterfield D.A., eds). Redox Proteomics - From Protein Modifications to Cellular Dysfunctions and Diseases. John Wiley and Sons, Inc. Hoboken, 2006. — Р. 3–23.

Традиционными объектами изучения процессов липопероксидации при различных формах нарушения кровообращения были и остаются сердце и головной мозг. Вместе с тем имеются органы и ткани, в частности почки, которые не менее уязвимы для повреждающих факторов ишемии и реперфузии [8], а нарушение их функций лежит в основе вторичных нарушений кровообращения, водно-солевого обмена и интоксикации организма [7]. Увеличение образования продуктов липопероксидации, а также уменьшение активности антиоксидантных систем в почках установлено в экспериментах с использованием различных моделей гипоксии-реоксигенации, ишемии-реперфузии [3]. Состояние системы свободнорадикального окисления (СРО) является универсальным неспецифическим критерием патологических процессов и представляет собой процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, кетонов, альдегидов, причем характерной чертой является его цепной самоиндуцирующийся характер [9].

Механизмы, определяющие особенности липопероксидации при ишемическом повреждении почек, вызванном остановкой системного кровообращения, и реперфузии, требуют дальнейшего изучения.

Целью настоящего раздела работы явилось изучение влияния новокаиновой паранефральной блокады на уровень образования продуктов ПОЛ в  корковом веществе почек крыс разного возраста и пола в динамике острой ишемии-реперфузии. 

Материалы и методы

В работе использованы 60 белых беспородных крыс обоего пола массой 200-250 г (молодые животные) и 300-350 г (старые животные). Исследование проводилось на модели «две почки, один зажим». Наркотизированные животные размещались в положении «на спине». Шерсть на животе удаляли, операционное поле обрабатывали 70°-ным этиловым спиртом. Разрез проводили вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекали кожу и соединительную ткань. Выделяли сосудистую ножку правой почки, которую затем клипировали зажимом Холстеда на 20 мин. Рану на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной стерильным физраствором. Через 20 мин зажим с почечной ножки снимали, тем самым восстанавливали кровоснабжение ишемизированной почки (реперфузия), операционную рану ушивали послойно. Через определенные промежутки времени от момента реперфузии (1 ч, 3 ч, 48 ч) крыс умерщвляли декапитацией на гильотине. Для исследования забирали правую (ишемизированную) и контралатеральную почки, выделяли корковый слой; 100 мг ткани промывали  фосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1 мл 1х PBS и оставляли на ночь при -20°C. Для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2-8°C). Супернатант отбирали, делили на аликвоты и хранили при -20°C или -80°C. Перед измерением размороженные образцы центрифугировали.

Блокаду паранефральной клетчатки осуществляли путем введения 0,1 мл 2%-ного раствора новокаина непосредственно перед проведением процедуры ишемии и повторно перед реперфузией. В гомогенатах тканей коркового слоя левой и правой почек были изучены уровни содержания малонового диальдегида [4] и диеновых конъюгатов [2].

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 6,0 c определением средних значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Существенными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Первичными продуктами ПОЛ являются диеновые конъюгаты, которые относятся к токсическим метаболитам, оказывающим повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты [6]. В исследовании Симион А.Ю. и соавт. [5] показана интенсификация перекисного окисления липидов при  ишемическом повреждении тканей печени, сердца и головного мозга, что может быть причиной дезинтеграции биологических мембран в условиях гипоксии. А наиболее высокий уровень первичных продуктов ПОЛ, который был выявлен в кардиомиоцитах, по мнению авторов, свидетельствует о высокой чувствительности ткани сердечной мышцы к гипоксии.

В нашем исследовании при ишемии-реперфузии почки в зависимости от пола и возраста лабораторных животных не получено подтверждения этому постулату. Напротив,  в корковом веществе    правой и левой почек интактных молодых самок и старых самцов, оказавшихся самыми устойчивыми к повреждающему действию  указанных факторов,  уровень  диеновых конъюгатов (ДК)   оказался  в 2 и более раз выше, чем в аналогичных тканях  старых самок и молодых самцов как наиболее чувствительных к патологическому действию ишемии-реперфузии (табл. 1). 

Таблица 1

Влияние новокаиновой блокады  на содержание диеновых конъюгатов (мкМ\г тк) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола и возраста

Примечание: ¹ - достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;

² - достоверно по отношению к показателю без блокады

В динамике восстановления кровотока  содержание первичных продуктов ПОЛ в корковом веществе почки, подвергнутой процедуре ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки было специфическим. Так,  у молодых самок и старых самцов в сроки  1 ч, 3 ч и 48 ч после восстановления кровотока уровень ДК снизился: в корковом веществе правой почки у самок  - в среднем  в 4,6 раза, у самцов - в 1,9 раза; левой почки у самок - в среднем в 2,6 раза, у самцов - в 1,6 раза. 

Иная динамика отмечена в корковом веществе почек старых самок и молодых самцов. Через 1 ч после восстановления кровотока в корковом веществе правой и левой почек найдены разнонаправленные изменения содержания ДК: в правой - увеличение в 1,6 раза и 1,5 раза у самок и самцов  соответственно; в левой - падение в 1,7 раза и 3 раза соответственно. Через 3 ч и 48 ч после восстановления кровотока снова отмечены разнонаправленные колебания уровня  ДК в правой и в левой контралатеральной почках старых самок и молодых самцов (табл. 1).

Активация процессов ПОЛ формирует цепи окисления с участием первичных (диеновые конъюгаты), промежуточных и конечных продуктов пероксидации. Эти приводит к  изменению проницаемости плазматических мембран, активности ферментов, изменяются свойства мембранных белков. По выраженности процессов ПОЛ можно судить о степени повреждения клеток.

Колебания уровня первичных продуктов ПОЛ сопровождались стойким накоплением одного из конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в динамике восстановления кровотока в органах всех групп животных. Вместе с тем в срок 48 ч  после реперфузии уровень МДА в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки  молодых самок и старых самцов был  значимо ниже, чем в органах старых самок и молодых самцов (табл. 2).

Таблица 2

Влияние новокаиновой блокады  на содержание малонового диальдегида (нМ/г тк) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола и возраста

Примечание: ¹ - достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;

² - достоверно по отношению к показателю без блокады.

Далее мы изучили влияние новокаиновой паранефральной блокады почки на образование первичных и одного из вторичных продуктов ПОЛ - МДА  в корковом веществе  почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки старых самок (неустойчивые) и старых самцов (устойчивые). Результаты отражены в таблицах 1 и 2.  Оказалось, что проведение новокаиновой блокады  приводило к стойкому одинаковому повышению уровня ДК в обеих почках в динамике восстановления кровотока. Так, через 1 ч  содержание  первичного продукта ПОЛ  в корковом веществе почек животных обеих групп составило в среднем 22,1 мкМ/г тк, через  48 ч  - 20,2 мкМ/г тк. Показатели не имели достоверных различий ни между животными разного пола, ни между опытной и контралатеральной почками, ни по времени восстановления кровотока.

Проведение новокаиновой блокады приводило к снижению уровня МДА.  Так, через 1 ч в корковом веществе старых самок снижение составило в среднем 1,7 раза  в правой и левой почках относительно показателей без блокады. В этот срок исследования в корковом веществе почек  самцов снижение уровня МДА составило 1,7 раза и 2,5 раза соответственно в правой и контралатеральной левой почке.

Через 48 ч от момента восстановления кровотока в корковом веществе почек старых самок уровень МДА снизился в среднем в 1,4  раза относительно аналогичного срока без блокады.  Для самцов такое снижение составило 1,4 раза и 1,9 раза в правой и левой почках соответственно.

Очевидно, что проведение новокаиновой блокады структур, иннервирующих почки животных, вызывало повышение уровня первичных продуктов ПОЛ при одновременном снижении вторичных продуктов.

Учитывая такие колебания уровня ДК и МДА в корковом веществе почек  между группами животных, устойчивых и неустойчивых  к воздействию ишемии-реперфузии,   мы сочли целесообразным рассчитать эффективность образования вторичных продуктов ПОЛ по коэффициенту ДК/МДА (табл. 3).

Таблица 3

Влияние новокаиновой блокады  на эффективность образования вторичных продуктов ПОЛ (ДК/МДА) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола

Примечание: ¹- достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;

² - достоверно по отношению к показателю без блокады.

Установлено, что  в динамике ишемии-реперфузии  повышалась интенсивность перехода первичных продуктов ПОЛ во вторичные продукты, в данном случае - МДА. Так, через 1 ч после восстановления кровотока в корковом веществе правой ишемизированной почки  показатель ДК/МДА снижался у старых самок в 5,8 раза, а у старых самцов - в 7,1 раза. В корковом веществе левой почки снижение составило  6 раз и 7 раз соответственно относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста. Через 48 ч в корковом веществе правой ишемизированной почки  показатель ДК/МДА снижался у старых самок в 1,8 раза относительно предыдущего срока исследования и в 10,5 раз относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста, а в левой контралатеральной  почке показатель, напротив, увеличился в 2,7 раза, но оставался в 2,2 раза ниже контрольных величин. В корковом веществе правой почки старых самцов в этот срок  исследования коэффициент  ДК/МДА  увеличивался в 1,3 раза относительно предыдущего срока исследования, но оставался в 5,5 раза ниже относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста.

Предварительное проведение новокаиновой блокады паранефральной клетчатки  проводило к нормализации коэффициента ДК/МДА  в корковом веществе левой контралатеральной почки обеих групп животных во все исследуемые сроки. В правой почке  старых самок новокаиновая блокада вызывала увеличение показателя относительно значений у животных без блокады: через 1 ч после восстановления кровотока - в 3 раза, через 48 ч - в 4,8 раза, но оно оставалось ниже показателя у интакных животных в 2,2 раза.  В правой почке  старых самцов новокаиновая блокада вызывала увеличение показателя относительно значений у животных без блокады: через 1 ч после восстановления кровотока - в 5,4 раза, через 48 ч - в 4 раза, оставаясь при этом ниже показателя у интакных животных лишь в 1,4  раза.     

Анализируя полученные результаты, следует отметить, что, с одной стороны, в исследовании подтвержден факт влияния ишемии-реперфузии на накопление продуктов свободнорадикального окисления, с другой - не совсем понятно синхронное  изменение содержания ДК и МДА в контралатеральной почке. Нет ясности в том, отражает ли это изменение активацию ПОЛ в ткани почки, как подвергнутой ишемии-реперфузии, так и контралатеральной, либо  другой конкретный ферментативный, генетически  обусловленный процесс синтеза эйкозаноидов - большого семейства высокоактивных соединений, обладающих необычайно широким спектром биологических эффектов.  Арахидоновая кислота является наиболее широко распространенным и, вероятно, самым важным предшественником эйкозаноидов. Известно, что образующиеся в процессе ее окисления гидроперекиси и циклические перекиси  не могут накапливаться в организме, они разлагаются до жирных альдегидов, например малонового. Арахидоновая кислота образует 3 молекулы малонового диальдегида. Продукты расщепления кислоты подвергаются дальнейшему окислению с образованием малоновой кислоты, простагландинов, в  дальнейшем из ПГН₂ в отдельных метаболических путях образуются другие простагландины, тромбоксан и простациклин. 

Нормализация эффективности образования МДА в обеих почках, т.е. подвергнутой ишемии-реперфузии и контралатеральной, под действием блокады паранефральной клетчатки новокаином, не обладающим антиоксидантными свойствами,  также не совсем понятна и требует дальнейших исследований.

Рецензенты:

Геворкян Ю.А., д.м.н., профессор, отделения «ОАО-2» ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Ушакова Н.Д., д.м.н., профессор, врач анестезиолог-реаниматолог ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.

Библиографическая ссылка