Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

Осиков М.В. 1 Кишкин А.М. 1 Федосов А.А. 1
1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России
Работа выполнена на 54 белых нелинейных крысах, разделенных на 3 группы: интактные животные, животные с термической травмой (ТТ), животные с термической травмой, которым вводили эритропоэтин (ЭПО). ТТ моделировали при контакте кожи в течение 30 с с нагретым до температуры 100 °С предметом (ожог IIIА степени), площадь ожога 4%. ЭПО («Рекормон», МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) вводился внутрибрюшинно, в суммарной дозе 1500 МЕ/кг массы. В периферической крови у крыс определяли количество Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов с использованием моноклональных антител CD3 и CD45RA соответственно. Гибель лимфоцитов путем некроза и апоптоза оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD). Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США). Th1- и Th2-зависимый ответ оценивали соответственно в реакции гиперчувствительности и по количеству антителообразующих клеток в селезенке крыс после иммунизации. Установлено, что при ТТ на 3-и сутки в крови снижается количество Т- и В-лимфоцитов, угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается количество лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза. Снижение количества Т- и В-лимфоцитов в крови, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа нарастает по мере увеличения количества лимфоцитов с признаками апоптоза и некроза. Применение ЭПО приводит к частичному или полному восстановлению количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза. Восстановление количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при ТТ в условиях применения ЭПО ассоциировано со снижением количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.
эритропоэтин.
адаптивный иммунитет
термическая травма
1. Осиков М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. - 2011. - Т. 17. - № 4. - С. 7-13.
2. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6. – URL: www.science-education.ru/106-7450 (дата обращения: 05.06.2015).
3. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в реализации тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 10-2. – С. 285-289.
4. Осиков М.В. Современные представления о гемостазиологических эффектах эритропоэтина / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-1. – С. 196-200.
5. Осиков М.В. Эритропоэтин как регулятор экспрессии тромбоцитарных гликопротеинов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1. – URL: www.science-education.ru/107-7731 (дата обращения: 05.06.2015).
6. Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4. – URL: www.science-education.ru/110-9973 (дата обращения: 05.06.2015).
7. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на показатели врожденного иммунитета в ранние сроки экспериментальной термической травмы / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, А.М. Кишкин, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 7-2. – С. 334-339.
8. Buchanan I.B. The effect of burn injury on CD8+ and CD4+ T cells in an irradiation model of homeostatic proliferation / I.B. Buchanan, R. Maile, J.A. Frelinger et al. // J. Trauma. – 2006. – Vol. 61 (5). – P. 1062-1068.
9. Fazal N. Inhibition of T cell MAPKs (Erk 1/2, p38) with thermal injury is related to down-regulation of Ca2+ signaling / N. Fazal, M.A. Choudhry, M.M. Sayeed // Biochim. Biophys. Acta. – 2005. – Vol. 1741 (1-2). – P. 113-119.
10. MacConmara M.P. Regulatory T cells suppress antigen-driven CD4 T cell reactivity following injury / M.P. MacConmara, G. Tajima, F. O'Leary et al. // J. Leukoc. Biol. – 2011. – Vol. 89 (1). – P. 137-147.

В динамике иммунологической реактивности при термической травме (ТТ) выделяют как минимум три фазы: период ранней иммунодепрессии, захватывающий первые дни после ожога; период компенсации, характеризующийся усилением иммунореактивности; период поздней иммунодепрессии, возникающий только после обширных повреждений. Сведения об изменении иммунного статуса в ранние сроки ТТ противоречивы, большинство исследователей отмечают активацию фагоцитов, изменение активности комплемента, концентрации в сыворотке иммуноглобулинов и др. опсонинов, депрессию клеточного звена адаптивного иммунитета, неоднозначны сведения о цитокиновом профиле. В то же время дисфункция иммунной системы при ТТ является причиной повышенной восприимчивости к условно-патогенной микрофлоре, гнойно-септических осложнений, септического шока, расширения зоны вторичной альтерации, полиорганной недостаточности и летальности, поэтому терапевтические подходы в комбустиологии в первые сутки ведения пациентов должны включать иммунокорригирующие подходы. В этом отношении перспективным фармакологическим агентом может выступить эритропоэтин (ЭПО). Ранее нами продемонстрировано протекторное влияние эритропоэтина (ЭПО) на иммунный статус при хронической почечной недостаточности, а также на врожденный иммунитет при ТТ [1-7].  Интерес к ЭПО обусловлен его плейотропными эффектами, включающими, кроме иммунотропного, кардиотропный, нефроцитопротекторный, антиоксидантный, стимулирующий репарацию тканей.

Цель работы - исследовать механизм влияния экзогенного ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальной ТТ.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 54 белых нелинейных крысах массой 180-220 г, находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., при свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии. Экспериментальные животные разделены на 3 группы: группа 1 - интактные животные (n=18), группа 2 - животные с термической травмой (n=18), группа 3 - животные с термической травмой, которым вводили ЭПО (n=18). Для создания модели ТТ использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С, время контакта с кожей для моделирования ТТ ІІІА степени составило 30 с. Площадь ожога вычисляли по формуле площади круга, в нашем эксперименте она составила 12,56 см². Для расчета поверхности тела у крыс использовали формулу Мее-Рубнера в модификации Lee: S=К•W0,6, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Площадь поверхности тела животных в нашем эксперименте составила 336,44±12,67 см². Так как абсолютная площадь ожога была одинаковой во всех случаях (12,56 см²), то относительная площадь ожога составила 3,97±0,14%, т.е. около 4%. ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) вводился внутрибрюшинно, начиная с 1-х суток, ежедневно в дозе 500 МЕ/кг массы в течение 3 дней, суммарная доза 1500 МЕ/кг. Контрольной группе животных с ТТ вводилось эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 3-и сутки. Забор крови проводили под общим ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) путем пункции левого желудочка сердца в вакуумные пробирки фирмы «Вакуэт» (Австрия).

Количество популяций лимфоцитов в периферической крови у крыс определяли методом прямой иммунофлуоресценции цельной крови с использованием моноклональных антител CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах, CD45RA (клон OX-33) - экспрессируется преимущественно на В-лимфоцитах. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в 109/л крови. Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, результат выражали в абсолютном количестве и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы волюмометрическим методом. Лимфоциты из периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности фиколла и урографина («ДНК-технология», Россия), концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3•106/л. Гибель лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в % клеток. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, наличие связи между показателями исследовали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Отличия считали значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. При экспериментальной ТТ в периферической крови количество Т-лимфоцитов (CD3+) снижается на 28%, количество В-лимфоцитов (CD45+) снижается на 27% средних значений в контрольной группе (таблица 1).

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на показатели адаптивного иммунитета при термической травме (M±m)

Показатели

1 группа

Интактные

2 группа

ТТ

3 группа ТТ+ЭПО

CD3+, •109/л

3,14±0,12

2,25±0,16

p1-2<0,01

4,55±0,22

p1-3<0,01

p2-3<0,01

CD45+, •109/л

2,22±0,14

1,60±0

p1-2<0,01

2,55±0,07

p2-3<0,01

Интенсивность реакции ГЗТ, мл

0,36±0,03

0,28±0,04

p1-2<0,01

0,68±0,01

p1-3<0,01

p2-3<0,01

АОК в селезенке, • 104 ед.

192,19±24,69

22,31±3,07

p1-2<0,01

24,77±2,21

p1-3<0,01

АОК в селезенке, • 106 ЯСК

125,33±33,50

30,75±2,91

p1-2<0,01

64,54±14,37

p1-2<0,01

p2-3<0,01

Развитие лимфоцитопении сопровождается депрессией Th1-зависимого иммунного ответа, что проявляется снижением интенсивности реакции ГЗТ на 22% от средних значений в контрольной группе. Депрессия Th2-зависимого иммунного ответа презентируется снижением количества антителообразующих клеток в селезенке в абсолютных величинах в 8,7 раза от средних значений в контрольной группе, в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке количество антителообразующих клеток снижается в 4,2 раза.

Одним из механизмов развития лимфоцитопении и депрессии Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа может выступать активация гибели иммунокомпетентных клеток. Результаты исследования гибели лимфоцитов периферической крови путем некроза и апоптоза представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)

Показатели

1 группа

Интактные

2 группа

ТТ

3 группа ТТ+ЭПО

Интактные клетки (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), % клеток

98,09±1,35

96,70±0,22

p1-2<0,01

97,75±0,20

p2-3<0,01

Ранний апоптоз (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), % клеток

1,62±0,09

2,90±0,27

p1-2<0,01

2,00±0,22

p2-3<0,01

Поздний апоптоз/некроз (Annexin-5-FITC+/7-AAD+),  % клеток

0,10±0,03

0,15±0,02

 

0,10±0

 

Некроз (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +), % клеток

0,19±0,03

0,25±0,07

p1-2<0,01

0,21±0,02

 

 

Установлено снижение представительства интактных клеток (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), увеличение количества клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), признаками некроза (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +). С использованием корреляционного анализа установлено наличие обратной средней силы связи между количеством лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза и количеством Т-лимфоцитов (коэффициент корреляции Спирмена R= - 0,45; р<0,05), В-лимфоцитов (R= - 0,41; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,57; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на  106 ядросодержащих клеток (R= - 0,51; р<0,05). Кроме того, зафиксирована обратная слабая связь между количеством лимфоцитов в крови с признаками некроза и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,39; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,35; р<0,05).

Применение ЭПО при экспериментальной ТТ приводит к увеличению количества Т-лимфоцитов (CD3+) и В-лимфоцитов (CD45+) в периферической крови, причем количество Т-лимфоцитов становится выше, чем в группе интактных животных. Интенсивность реакции ГЗТ, отражающая выраженность Th1-зависимого иммунного ответа, в условиях применения ЭПО повышается и становится статистически значимо выше, чем в группе интактных животных. ЭПО повышает количество АОК в селезенке в пересчете на
106 ядросодержащих клеток, однако их количество не достигает значений в группе интактных животных.

Одним из механизмов влияния ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при ТТ выступает ограничение апоптоза лимфоцитов. В условиях применения ЭПО повышается количество интактных лимфоцитов (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), снижается количество клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-). По данным корреляционного анализа, наблюдается отрицательная средней силы связь между количеством клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-) и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,52; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,59; р<0,05) и отрицательная слабая связь с количеством В-лимфоцитов (R= - 0,33; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (R= - 0,38; р<0,05).

По данным других исследователей, уже в раннем периоде после ТТ происходят выраженные дистрофические изменения в тимусе, вызывающие глубокую депрессию Т-клеточного звена иммунитета, которая проявляется как в снижении общего количества Т-лимфоцитов, так и различных субпопуляций с изменением их функциональной активности. Степень снижения числа Т-лимфоцитов находится в определенной зависимости от тяжести ТТ [9; 10]. Определенную роль в подавлении активности Т-лимфоцитов при ТТ, в частности ответ CD4+ наивных клеток на антигенную стимуляцию и формирование клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, играют Т-регуляторные лимфоциты (Tregs). В Т-лимфоцитах при ТТ нарушены механизмы внутриклеточной сигнализации, опосредованные митоген-активируемыми протеинкиназами и Са2+ [8]. Протеинкиназа С опосредует цАМФ-зависимые  эффекты простагландина Е2 в подавлении активности Т-лимфоцитов после ТТ. Механизм нарушения функции Т-лимфоцитов окончательно не определен, о чем свидетельствуют многочисленные сведения, зачастую противоречивого характера. Одним из механизмов подавления функциональной активности Т-лимфоцитов при ожогах выступает повышение концентрации в плазме протеина HMGB1 (high mobility group box-1), обратно коррелирующее с отношением CD4/CD8. Кроме повышенной гибели лимфоцитов по механизму апоптоза в качестве альтернативной причины Т-клеточной дисфункции рассматривается и другой механизм: активная супрессия вследствие раннего смещения цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов. Причем выраженность апоптоза лимфоцитов, как было установлено в TUNEL-тесте у крыс при ТТ, зависит от уровня эндотоксинемии. Получены сведения о значимой корреляции полиморфизма гена CD14+ и Т-клеточного иммунитета, что, в частности, предрасполагает к развитию септических осложнений у ожоговых пациентов.

Наряду с изменениями клеточного иммунитета при ТТ происходит снижение количества В-лимфоцитов. Однако В-система характеризуется большей устойчивостью, изменение гуморального иммунного ответа характеризуется сдвигами в концентрации иммуноглобулинов. Большинство исследователей наблюдали уже на 1-3 сутки после ТТ снижение уровня Ig М, Ig А, а в случае глубоких ожогов увеличение содержания Ig G. Направленность и величина отклонений в уровне иммуноглобулинов зависит не только от активности антителообразующих клеток, но и от их количества, которое уменьшается в результате плазмореи, распада их вследствие повышения активности протеолитических ферментов.

Выводы

1.                  При экспериментальной термической травме в периферической крови снижается количество Т- и В-лимфоцитов, угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается количество лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

2.                  Снижение количества Т- и В-лимфоцитов в крови, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере увеличения количества лимфоцитов с признаками апоптоза и некроза.

3.                  Применение эритропоэтина в суммарной дозе 1500 МЕ/кг приводит к частичному или полному восстановлению количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

4.                  Восстановление количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при экспериментальной термической травме в условиях применения эритропоэтина ассоциировано со снижением количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

Рецензенты:

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                   г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                    г. Челябинск.

 


Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Кишкин А.М., Федосов А.А. МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=20146 (дата обращения: 19.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074