Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ СТОЙКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ – ПЕРФТОРКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Шарипов Д.А. 1 Юлгутлина Э.В. 1 Четвериков С.П. 1
1 ФГБУН Уфимский Институт биологии РАН
В данной статье рассмотрена проблема микробиологической деструкции такого класса стойких органических загрязнителей, как перфторкарбоновые кислоты на примере перфторэнантовой кислоты. Из почвенных проб с территории промышленных предприятий Республики Башкортостан, а также образцов грунта, отобранных около мест хранения средств тушения пожаров, выделены активные штаммы-деструкторы перфторэнантовой кислоты. По результатам предварительной идентификации на основе морфологических, физиологических и биохимических признаков изоляты являются представителями классов Alphaproteobacteria(порядок Rhizobiales), Gammaproteobacteria, Actinbacteria. По выходу свободных фторид – ионов в среду оценено деструктирующее воздействие микроорганизмов на перфторэнантовую кислоту, степень биодеструкции этой кислоты доходит до 63,8% за 35 суток инкубации. Выделенные бактерии, имея большой деградативный потенциал, являются перспективными для создания биологических препаратов – деструкторов стойких органических загрязнителей – перфторорганических соединений.
перфторорганические кислоты.
деструкторы
бактерии
1. Коршунова Т.Ю., Шарипов Д.А., Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonassp., разлагающие 2,4 – дихлорфеноксиуксусную кислоту // Материалы III Всероссийской школы-конференции «Биомика – наука XXI». – Уфа, 2012. – С. 57.
2. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта. – М.: Мир, 1984. – Т.3. – 264 с.
3. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулт. – М.: Мир, 1997. – Т.1, 2.
4. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н. С. Егорова. – М.: Изд-воМоск. ун-та, 1983. – 215 с.
5. Anderson M.E., Butenhof J.L., Chang S. Perfluoroalkyl acids and related chemistries — Toxicokinetics and Modes of Action // Toxicological Sciences. – 2008. –V. 102. –Р. 3–14.
6. Apelberg B.J., Witter F.R., Herbstman J.B.. Cord serum concentrations of perfluorooctanesulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) in relation to weight and size at birth // Environmental Health Perspectives. – 2007. –V. 115. – P. 1670–1676.
7. Betts K. PFOS and PFOA in humans: new study links prenatal exposure to lower birth weight // Environmental Health Perspectives. – 2007. –V. 115. – P. 550.
8. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Industr. Microbiol. – 1961. –V. 2. – P. 23–32.
9. Tao L., Kannan K., Kajiwara N. Perfluorooctanesulfonate and related fluorochemicals in Albatrosses, Elephant Seals, Penguins, and Polar Skuas from the Southern Ocean // Environmental Science and Technology. – 2006. –V. 40. –Р. 7642–7648.
10. Yamashita N., Kannan K., Taniyasu S. A global survey of perfluorinated acids in oceans // Marine Pollution Bulletin. – 2005. –V. 51. –Р. 658–668.
Современному росту химической промышленности и органического синтеза в частности сопутствует загрязнение окружающей среды широким спектром ксенобиотиков, которые детектируются в составе компонентов природных геосистем, обладают токсичностью, биоаккумуляцией и устойчивостью к разложению. Многие из этих поллютантов являются галогенированными соединениями, часто обнаруживаемыми в потоках отходов, а их токсические свойства в свое время стимулировали исследования по их микробному метаболизму. Самыми устойчивыми из них являются фторсодержащие соединения.

Фторированные соединения используются в качестве агрохимикатов, лекарственных препаратов. Фторсодержащие компоненты являются ингибиторами ферментов и модификаторами межклеточных коммуникаций, они способны также к нарушению мембранного транспорта и процессов преобразования энергии.

Благодаря своеобразию свойствперфторкарбоновых кислот и возможности широко использовать их для научных и промышленных целей, они служат объектом интенсивных исследований и в настоящее время являются хорошо изученной группой веществ.

Перфторкарбоновые кислоты – синтетические химические соединения, применяемые в производстве широко используемых фторполимеров. Они также являются поверхностно-активными веществами, обладают высокой химической стабильностью, что делает их идеальными материалами для широкого применения (например, антипригарное покрытие для посуды, влаго- и пятностойкие покрытия для текстиля, смазки, упаковка пищевых продуктов, противопожарная пена и т. д.). Будучи крайне устойчивыми к биоразложению, перфторкислоты к настоящему времени обнаруживаются во многих объектах окружающей среды и живых организмах. Например, перфтороктановая кислота является наиболее часто детектируемым загрязнителем этого класса [9, 10]. Исследования показывают, что перфторкарбоновые кислоты очень медленно выводятся из организма человека – от 2 лет до 21 года, практически не подвергаются метаболизму и накапливаются в организме (в основном в почках и печени) [5]. Также они влияют на репродуктивную и эндокринную системы [6, 7], доказаны их канцерогенные свойства [5].

Перфторкарбоновые кислоты внесены в Приложение В Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязняющим (СОЗ) веществам, что предусматривает принятие мер по минимизации и, по возможности, прекращению производства и использования. И в свою очередь более остро встает проблема утилизации этих экологически опасных поллютантов неприродного происхождения со всеми вытекающими последствиями по их включению в естественный обмен веществ и энергии с участием микроорганизмов, которые минерализуют их, не оказывая отрицательного влияния на окружающую среду. Поэтому целью данной работы являлось выделение и характеристика перспективных бактерий для деструкции стойких органических загрязнителей –перфторкарбоновых кислот на примере перфторэнантовой кислоты (рис. 1).

 

http://www.fluorine.ru/upload/iblock/968/9681780a8d71367f4745bfa3e16619b8.gif

Рис. 1. Перфторэнантовая (перфторгексановая) кислота

Материалы и методы исследования

Выделение штаммов-деструкторов перфторорганических кислот производили из образцов почв с территории промышленных предприятий (Республики Башкортостан), а также образов грунта, отобранных около мест хранения средств тушения пожаров (Мальдивская Республика). Для получения микроорганизмов методом накопительных культур 1 г почвы помещали в колбы (объем 250 мл) со 100 мл жидкой минеральной среды Раймонда [8] (г/л): Na2CO3 – 0,1; MgSo4 ×  7 H20 – 0,2; FeSo4 × 7 H2O – 0,02 ; CaCl2 – 0,01; MnSo4 × 7 H2O – 0,02; K2HPO4 × 3 H2O – 1,0; NaH2PO4 × 3 H2O – 1,5; NH4Cl – 3 [13]. В качестве единственного источника углерода и энергии вносили стерильную перфторэнантовую (перфторгексановую) кислоту в количестве 0,1 % (по объему). Культивирование проводили в статических условиях при температуре 28ºС в течение 7 суток при периодическом встряхивании. Бактериальные штаммы выделяли из накопительных культур на агаризованной минеральной среде Раймонда без пептона, на поверхность которой наносили углеводородный субстрат – 100 мкл стерильной перфторэнантовой кислоты. Культивирование микроорганизмов в чашках Петри осуществляли при температуре 28 ºС. Изолирование получившихся колоний микроорганизмов проводили по морфолого-физиологическим признакам.

Чистоту выделенных культур проверяли общепринятыми методами – микроскопическим контролем и высевом на агаризованную среду МПА [4].

Характеризацию чистых культур микроорганизмов – деструкторов фторорганических соединений проводили по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам, используя общепринятые руководства [2, 3].

Культивирование штаммов проводили в колбах со 100 мл питательной среды Раймонда без пептона, в которую инокулировали 1 мл бактериальной суспензии. В качестве источника углерода и энергии добавляли перфторэнатовую кислоту в количестве 0,2 г. Инкубирование осуществляли в стационарных условиях при температуре 28 ºС в течение 5 недель, на протяжении которых несколько раз измеряли титр микроорганизмов и динамику изменения фторид-иона (F-) в среде.

Способность к деструкции оценивали по способности роста в жидкой среде с единственным источником углерода в виде фторкарбоновой кислоты. Каждую колбу инокулировали бактериальной суспензией до начальной оптической плотности (ОП) при 450 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм около 0,02. Определение оптической плотности бактериальных суспензий проводили на спектрофотометре модели СФ-56 (Россия). Инкубирование осуществляли при температуре 28 ºС в течение 5 недель, на протяжении которых несколько раз измеряли оптическую плотность бактериальной суспензии.

Концентрацию фторид-иона в среде измеряли при помощи ионселективного кристаллического электрода ЭЛИС-131F (ООО «Измерительная техника», Россия).

Результаты и их обсуждение

В ходе проведенной работы из исследованных образцов методом накопительных культур было выделено 9 бактериальных штаммов, способных использовать перфторэнантовую кислоту в жидкой среде в качестве единственного источника углерода и энергии (маркировка М у штаммов, выделенных из образцов из Мальдивской Республики, цифровая – Республики Башкортостан).

Установлено, что среди выделенных штаммов были как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Все изоляты аэробные, каталазоположительные, оксидазоположительные, растущие в интервале температур 10–35 °С.

Все новые выделенные бактерии-деструкторы были способны к нитратредукции, использовали в качестве источника углерода широкий спектр органических веществ (таблица).

Признаки штаммов штаммов-деструкторов перфторэнантовой кислоты

Свойства

1.1

1.2

1.3.2

2.4

М1

М2

М3

М4

Образование индола

+

+

+

+

+

-

-

-

Рост на среде Эшби

-

-

-

-

-

-

-

-

Гидролиз крахмала

+

+

+

+

+

+

+

+

Разжижение желатина

+

+

-

-

+

+

+

+

Каталазная активность

+

+

+

+

+

+

+

+

Образование сероводорода

-

-

-

-

-

+

-

+

Образование аммиака из аргинина

-

-

-

+

-

-

+

-

Реакция Фогес-Проскауэра

-

-

-

-

-

-

-

-

Лецитиназа

+

+

-

+

-

+

+

+

Ассимиляция субстратов

Сахароза

+

+

-

-

+

+

-

-

Глюкоза

+

+

+

-

+

+

-

+

Глицерин

+

+

-

-

+

+

-

+

Галактоза

-

-

-

-

+

-

-

+

Рамноза

-

+

-

-

+

-

-

+

Мальтоза

+

-

+

-

+

+

-

+

Фруктоза

+

+

-

-

+

+

-

+

Ксилоза

+

+

-

-

+

+

-

+

Таким образом, изолированные штаммы-деструкторы по результатам предварительной идентификации являлись представителями классов Alphaproteobacteria(порядок Rhizobiales), Gammaproteobacteria, Actinbacteria. Работа по уточнению родовой и видовой принадлежноститребует привлечения генетических методов и филогенетического анализа.

Далее было показано (рис. 2), что ОП культуральных жидкостей растущих бактериальных культур находились в интервале 0,2–0,4 о.е. Максимальный уровень роста показывали штаммы М1, 1.3.02, 2.4 и 2.1, причем штамм 2.4 был описан еще и в качестве деструктора хлорорганических соединений [1], в частности 2,4 – дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), являющейся основой для ряда гербицидов. Максимумы ОП культуральных жидкостей наблюдали на седьмые сутки культивирования, после которых увеличения концентрации биомассы и ОП при 450 нм не наблюдалось, но не наблюдалось и ее снижения, что, возможно, свидетельствует о накоплении промежуточных продуктов.

Анализ данных по высвобождению ионов фтора в среду (рис. 3) показал, что перфторкарбоновые кислоты, судя по всему, очень тяжело подвергаются биодеструкции, с этим, вероятно, также связан долгий период адаптации Изучаемых культур микроорганизмов к субстрату, который в наших условиях составил 7 суток.

В среду было внесено 0,2 % субстрата в виде пефторгексановой кислоты, т.е. 6,4 mM, а с учетом, что она состоит из фтора на 66,6 %, следует, что в среду вносили 4,2 mM фтора. По выходу свободных фторид – ионов в среду в результате деструктирующего воздействия микроорганизмов на перфторкислоту была определена степень биодеструкции этой кислоты. Для лучших штаммов ее величина составила более 30 % и находилась на уровне для следующих штаммов: 1.3.02 – 63,8%, 2.4 – 42,6%, 1.2 – 41,4 %, М1 – 30,0 %, остальных – менее 20%.

Рис. 2. Динамика роста штаммов-деструкторов в жидкой минеральной среде, содержащей перфторэнантовую кислоту

Рис. 3. Динамика изменения концентрации фторид-иона в жидкой минеральной среде, содержащей перфторэнантовую кислоту, при росте штаммов-дестркуторов

Заключение

Основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что выделенные бактерии – деструкторы перфторэнантовой кислоты, имея большой деградативныйпотенциал, способны к росту и утилизации фторорганических субстратов и являются перспективными для создания биологических препаратов – деструкторов стойких органических загрязнителей – перфторорганических кислот.

Рецензенты:

Горбунова В.Ю., д.б.н., заместитель заведующего кафедры генетики, ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы»,г. Уфа;

Чемерис А.В., д.б.н., заместитель директора по научной работе, ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, лаборатория молекулярной биологии и нанобиотехнологии,  г. Уфа.


Библиографическая ссылка

Шарипов Д.А., Юлгутлина Э.В., Четвериков С.П. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ СТОЙКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ – ПЕРФТОРКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=20027 (дата обращения: 20.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074