Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИЗУЧЕНИЕ КАРОТИНОИДОВ ТЫКВЫ МЕТОДАМИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Курегян А.Г. 1
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России
Каротиноиды – это растительные пигменты, фармакологическая активность которых наиболее широко используется в профилактических и терапевтических целях. Выбор доступного источника получения каротиноидов, экстрагента и режима их экстракции является актуальной задачей. В статье представлены данные по анализу каротиноидного состава извлечений из мякоти плодов CucurbitamaximaDuch. методами спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии. Изолирование суммы каротиноидов проводили гексаном, хлороформом и ацетоном. Результаты спектрофотометрического исследования полученных извлечений показали присутствие в них суммы каротиноидов, при этом спектры поглощения гексанового и ацетонного экстрактов имели профили, характерные для каротиноидов. Методом ТСХ установлено, что качественный состав гексанового извлечения значительно шире, при этом составы ацетонового и хлороформного извлечений можно считать практически идентичными. Сравнение результатов анализа извлечений методом спектрофотометрии и ТСХ показал, что необходимо повысить очистку получаемых извлечений.
каротиноиды
Cucurbita maxima Duch.
спектрофотометрия
ТСХ
1. Оленников Д.Н., Зилфикаров И.Н., Ибрагимов Т.А. Исследование химического состава алоэ древовидного (Aloearborescens Mill.) // Химия растительного сырья. 2010. № 3. С.77-82.
2. Печинский С.В., Курегян А.Г. Влияние каротиноидов на иммунитет // Хим.-фармац. журн. – 2013. – Т. 47. – № 10. – С. 3–8.
3. Печинский С.В., Курегян А.Г. Структура и биологические функции каротиноидов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2013. – № 9. – С. 4–15.
4. Писарев Д.И., Новиков О.О., Романова Т.А. Разработка экспресс-метода определения каротиноидов в сырье растительного происхождения // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. – 2010. – № 22 (93). – Вып. 12/2. – С. 119–122.
5. Саввин П.Н. Исследование натуральных каротиноидно-антоциановых красителей / П.Н. Саввин, Е.В. Комарова, В.М. Болотов и др. // Химия растительного сырья. – 2010. – № 4. – С. 135–138.
6. Рудаков О.Б. Хроматографическое определение натуральных и искусственных каротиноидов в пищевых продуктах / О.Б. Рудаков, Л.И. Перикова, В.М. Болотов и др.// Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2004. – №4. – С. 78–84.
7. Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H. Carotenoids Handbook. Basel.: Springer Basel AG, 2004. – 646 р.
8. Handbook for Carotenoid Analysis Delia B. Rodriguez-Amaya and Mieko Kimura. – Washington.: Copyright HarvestPlus, 2004. – 59 р.
9. Muntean E. Quantification of carotenoids from pumpkin juice by HPLC-DAD / Scientifical Researches. Agroalimentary Processes and Technologies. – 2005. – №1 (11). – Р. 123–128.
10. Rosdina Rahiman, Mohd Alauddin Mohd Ali, Mohammad Syuhaimi Ab-Rahman Carotenoids Concentration Detection Investigation: A Review of Current Status and Future Trend // International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics. – 2013. – № 5 (3). – Р. 446 – 472.
Каротиноиды наравне с антоцианами являются наиболее распространенным классом растительных пигментов, который применяется для профилактики заболеваний и имеет широкие перспективы использования в клинической практике. Физиологическая роль каротиноидов достаточно разнообразна, кроме того, эти биологически активные вещества (БАВ) обладают обширным перечнем фармакологических свойств, например, антиоксидантной, радиопротекторной, провитаминной, антиканцерогенной и другими видами активности [2,3, 8]. Актуальной задачей является выбор источника получения этих БАВ и экстрагента, позволяющего экстрагировать каротиноиды в режиме с наименьшим количеством стадий, извлекая эти соединения с минимальным количеством сопутствующих соединений.

Цель исследования - сравнительный качественный анализ извлечений из плодов Cucurbitamaxima Duch. для дальнейшего выбора органического растворителя с целью экстракции каротиноидов.

Объекты и методы. В качестве источника каротиноидов была использована мякоть плодов Cucurbitamaxima Duch. Основываясь на физико-химических свойствах этого класса БАВ и учитывая их растворимость [4, 6], в качестве экстрагентов были выбраны гексан, хлороформ и  ацетон. Для выделения каротиноидов из сырья применили метод жидкостной экстракции с соотношением сырье:экстрагент - 1:5.

Методика получения извлечения. Мякоть плодов Cucurbitamaxima Duch. предварительно измельчали, добавляя гидрокарбонат натрия с целью нейтрализации органических кислот. Около 5,0 г измельченного сырья (точная навеска) трижды экстрагировали гексаном или хлороформом, или ацетоном порциями по 25 мл при постоянном помешивании в делительной воронке при комнатной температуре до обесцвечивания сырья. Полученные порции извлечений объединяли и подвергали  качественному анализу.

 В связи с тем, что каротиноиды являются светочувствительными соединениями, на всех этапах изолирования уменьшали воздействия света, оборачивая колбы и делительные воронки фольгой, а промежуточные продукты хранили в банках оранжевого стекла в темном месте.

Разделение суммы каротиноидов и качественный анализ полученных экстрактов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), дополнительно для идентификации изолированных БАВ применяли метод УФ-спектрофотометрии.

Методика спектрофотометрического анализа. По 1 мл гексанового или хлороформного, или ацетонового извлечения помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл и доводили объемы растворов до метки гексаном, хлороформом и ацетоном соответственно.

Для полученных растворов регистрировали спектры поглощения на спектрофотометре СФ-2000 в диапазоне от 250 до 700 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм, в качестве растворов сравнения  использовали гексан, хлороформ и ацетон соответственно.

Методика ТСХ анализа. На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» размером 10×20 см наносили по 5 мкл гексанового или хлороформного, или ацетонового извлечений  и  раствора  стандартного образца β-каротина, сушили при комнатной температуре в течение 5 мин, предохраняя пластинки с нанесенными образцами от действия света.

Пластинку помещали в хроматографическую камеру, насыщенную парами подвижной фазы.

В качестве подвижных фаз использовали следующие смеси растворителей:

  • диэтиловыйэфир - петролейный эфир (3:1) - система I;
  • петролейный эфир - диэтиловый эфир - кислота уксусная (85:15:1) - система II;
  • петролейный эфир - гексан (10:1) - система III.

Когда фронт подвижной фазы проходил около 15 см, пластинку вынимали из камеры, сушили  при комнатной температуре.

Детекцию пятен первоначально проводили по окраске зон адсорбции. Далее хроматограммы обрабатывали 10 % раствором кислоты фосфорномолибденовой и нагревали до 60 °С в течение 10 мин. Зоны адсорбции, соответствующие каротиноидам, проявлялись в виде синих пятен на зелено-желтом фоне [1].

Результаты и их обсуждение. Согласно литературным данным основной каротиноидный состав плодов Cucurbitamaxima Duch.  представлен β-каротином, виолаксантином, кукурбитаксантином, α-крипоксантином, β-крипоксантином, лютеином, зеаксантином,  неоксантиноми следовыми количествами других каротиноидов [8,9].

Электронные спектры поглощения растворов производных каротина характеризуются, как правило, тремя максимума или двумя максимумами и плечом в интервале длин волн от 270 до 550 нм. Антоциановые красители поглощают около 549 нм [4,5].

Спектры поглощения полученных гексанового и ацетонового извлечений имели по три максимума поглощения, которые находились в области, присущей каротиноидным соединениям:  429, 448, 474 нм в ацетоне и 426, 447, 472 нм в гексане. Спектр раствора хлороформного извлечения не имел выраженного «каротиноидного профиля», однако имелись максимумы поглощения при 408, 433 нм  и плечо около 455 нм. На спектрах всех извлечений отсутствовали максимумы поглощения около 550 нм, характерные для антоцианов.  

В соответствии с данными литературы спектр поглощения раствора β-каротина в ацетоне имеет максимумы при 429, 452, 478 нм, в тех же условиях  для α-каротина - 424, 448, 476 нм, для зеаксантина - 430, 452, 479 нм, для неоксантина - 416, 440, 470 нм.

Растворы в гексане имеют следующие максимумы поглощения: для β-каротина - 425, 450, 477 нм; для α-каротина - 422, 445, 473 нм;  для зеаксантина - 424, 449, 476 нм, неоксантина - 416, 438, 467 нм, для кукурбитаксантина - 427, 453, 483 нм.

Растворы в хлороформе:  спектр раствора β-каротина - максимумы при 435,461, 485 нм;  α-каротина -  433, 457, 484 нм; зеаксантина - 433, 462, 493 нм, неоксантина - 423, 448, 476 нм.

Кроме положений максимумов для идентификации каротиноидов методом спектрофотометрии используется расчет соотношения высот максимумом поглощения, в частности отношение третьего максимума ко второму, выраженное в процентах - III/II [7, 8, 10].

После сравнения максимумов поглощения полученных спектров с литературными сведениями  и положениями максимумов оптической плотности на спектре раствора СО β-каротина установлено, что  гексановое извлечение преимущественно содержит β-каротин, что подтверждается величиной соотношения III/II - 25,9 %, согласно данным литературы этот параметр должен составлять - 25 % [7, 8]. Наиболее вероятным сопутствующим каротиноидом  является α-каротин, однако соотношение III/II для этого каротиноида должно быть 55 %.

Анализ характера спектра поглощения ацетонового экстракта показал, что по положению первого максимума (428 нм) он наиболее близок к спектру поглощения β-каротина, второго (448 нм)  и третьего (476 нм) - к спектрам поглощения α-каротина и зеаксантина.  Соотношение III/II для спектра раствора β-каротина в ацетоне должно быть - 15 %, расчетное значение составило - 9 %.

Далее все извлечения были проанализированы методом ТСХ в системах растворителей: диэтиловыйэфир-петролейный эфир (3:1) - I; петролейный эфир-диэтиловый эфир-кислота уксусная (85:15:1) - II, петролейный эфир-гексан (10:1) - III.

Система I  позволила разделить шесть соединений каротиноидного типа в гексановом извлечении с коэффициентами подвижности: 0,024; 0,065; 0,230 (β-криптоксантин); 0,336 (зексантин); 0,451 (лютеин); 0,746 (β-каротин).

По четыре соединения были зафиксированы в хлороформном извлечении: 0,065; 0,230 (зексантин); 0,443 (лютеин); 0,750(β-каротин) и  ацетоновом экстракте - 0,066; 0,123; 0,234 (зексантин); 0,750 (β-каротин).

В системе растворителе II были разделены по два соединения в гексановом извлечении: 0,284; 0,850 (β-каротин); в хлороформном: 0,31; 0,845 (β-каротин);  и ацетоновом: 0,284; и 0,845 (β-каротин).

Смесь растворителей III разделить компоненты всех трех извлечений не позволила, т.к. нанесенные извлечения в виде зон адсорбции находились на линии страта.

Таким образом, результат анализа извлечений в хроматографической системе I показал, что качественный состав гексанового извлечения значительно шире, при этом составы ацетонового и хлороформного извлечений можно считать практически идентичными. Система II показала наличие двух каротиноидов в каждом из извлечений, причем, для всех трех экстрактов был идентифицирован β-каротин. Система растворителей III не дала разделения каротиноидов.

Выводы. По результатам спектрофотометрического анализа для дальнейшей работы в качестве экстрагентов были выбраны гексан и ацетон. В ходе исследования извлечений методом ТСХ установлено, что наибольшее число каротиноидных соединений содержит гексановое извлечение из сырья. Сравнение результатов анализа извлечений методами  спектрофотометрии и ТСХ, показал, что необходимо повысить очистку всех получаемых извлечений.

Рецензенты:

Оганесян Э.Т., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ, г. Пятигорск;

Компанцев В.А., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры неорганической химии Пятигорского   медико-фармацевтического  института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ, г. Пятигорск.


Библиографическая ссылка

Курегян А.Г. ИЗУЧЕНИЕ КАРОТИНОИДОВ ТЫКВЫ МЕТОДАМИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 1-2. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=19732 (дата обращения: 07.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074