Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Осиков М.В. 1 Черепанов Д.А. 1 Федосов А.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России

Предыдущие исследования позволили продемонстрировать в клинических и экспериментальных условиях изменение иммунного статуса в терминальную стадию хронической почечной недостаточности (ХПН) – активацию эффекторов врожденного иммунитета и депрессию адаптивного иммунитета. Одним из факторов патогенеза иммунной дисфункции при ХПН может выступать паратиреоидный гормон (ПТГ), в избытке продуцируемый в условиях вторичного гиперпаратиреоза (ГПТ). В этой связи на роль корригирующих факторов иммунного статуса претендуют блокаторы кальциевых каналов. Цель работы – исследовать иммунный статус при экспериментальном ГПТ и влияние на него блокатора кальциевых каналов амлодипина. Проверка гипотезы выполнена на 90 белых нелинейных крысах-самцах, разделенных на 3 группы: 1 — интактные, 2 — ГПТ, 3 — ГПТ и введение амлодипина. ГПТ у крыс 2-й группы моделировали путем содержания животных на синтетической гиперфосфатной смеси (0,6% кальция и 4,2% фосфора) в течение 120 дней, верифицировали повышением концентрации ПТГ в сыворотке. Животным 3-й группы с 120-х суток эксперимента ежедневно вводили препарат «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней. В периферической крови определяли количественный состав лейкоцитов, функциональную активность нейтрофилов по поглотительной способности и генерации активных форм кислорода в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте. Th1- и Th2-зависимый ответ оценивали соответственно в реакции гиперчувствительности замедленного типа и по количеству антителообразующих клеток в селезенке после иммунизации. Установлено, что при гиперпаратиреозе развиваются лимфоцитопения, активация генерации активных форм кислорода нейтрофилами и угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа. Угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере снижения количества лимфоцитов в крови. Применение амлодипина в суммарной дозе 1,75 мг/кг при гиперпаратиреозе приводит к восстановлению количества лимфоцитов в крови и показателей Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа, активации поглотительной способности и снижению функционального резерва генерации активных форм кислорода нейтрофилами.

Статья в формате PDF

135 KB

амлодипин

блокаторы кальциевых каналов

гиперпаратиреоз

иммунный статус

иммунитет

1. Осиков М.В. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на процессы свободно-радикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.

2. Осиков М.В. Влияние гемодиализа на процессы свободно-радикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2007. – № 16 (71). – С. 95–97.

3. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143–145.

4. Осиков М.В. Реактивные изменения клеточно-гуморальной системы организма как типовой патологический процесс и его регуляция реактантами острой фазы: автореф. дис.... д-ра мед. наук. – Челябинск, 2008. – 44 с.

5. Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4. – URL: www.science-education.ru/110-9973 (дата обращения: 10.04.2015).

6. Осиков М.В. Современные представления о гемостазиологических эффектах эритропоэтина / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов //Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-1. – С. 196–200.

7. Draper H.H. Osteoporosis in aging rats induced by high phosphorus diets / H.H. Draper, T.L. Sie, J.G. Bergan // J. Nutr. – 1972. – Vol. 102(9). – Р. 1133–1141.

8. Geara A.S. Effects of parathyroid hormone on immune function / A.S. Geara, M.R. Castellanos, C. Bassil et al. // Clin. Dev. Immunol. – 2010. – doi: 10.1155/2010/418695. – URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20886005 (дата обращения: 31.01.2015).

9. Seeliger S. The parathyroid hormone-2 receptor is expressed on human leukocytes and down-regulated in hyperparathyroidism / S. Seeliger, M. Hausberg, I. Eueet et al. // ClinNephrol. – 2003. – Vol. 59(6). – Р. 429-435.

10. Vaziri N.D. Effect of uremia on structure and function of immune system / N.D. Vaziri, M.V. Pahl, A. Crum [et al.] // J. Ren. Nutr. – 2012. – Vol. 1. – Р. 149–156.

Ранее нами продемонстрировано изменение иммунного статуса при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и в экспериментальных условиях, выражающееся в активации эффекторов врожденного иммунитета и подавлении адаптивного иммунитета [2, 5]. Регуляторы гомеостаза эндогенного происхождения (гормоны, реактанты острой фазы и др.) могут выступать в роли факторов патогенеза и рассматриваться как перспективные агенты коррекции нарушений гомеостаза [1, 3, 4, 6]. При ХПН одним из факторов патогенеза изменений иммунного статуса может выступать паратиреоидный гормон (ПТГ), в избытке циркулирующий в крови в условиях вторичного гиперпаратиреоза (ГПТ). ГПТ и сопутствующие ему изменения фосфорно-кальциевого гомеостаза приводят к накоплению ионизированного кальция в цитоплазме иммунокомпетентных клеток, поэтому обоснованным способом коррекции их функционального статуса и количественного представительства может быть применение блокаторов кальциевых каналов.  Цель работы - исследовать иммунный статус при экспериментальном гиперпаратиреозе и влияние на него блокатора кальциевых каналов амлодипина.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 90 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах массой 200-220 г, находящихся в стандартных условиях вивария, случайным образом разделенных на 3 группы: I - интактная, II - ГПТ, III - ГПТ и введение блокатора кальциевых каналов амлодипина. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. ГПТ у крыс II группы моделировали содержанием на гиперфосфатной диете по методу Draper H.H. etal. [7] в нашей модификации. В течение 120 дней рацион крыс состоял из синтетической гиперфосфатной смеси (0,6% кальция и 4,2% фосфора). Развитие ГПТ верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Животным III группы начиная с 120-х суток эксперимента ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза 1,75 мг/кг. Кровь для исследований забирали пункцией левого желудочка сердца. Количество лейкоцитов в крови определяли общепринятым меланжерным методом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе, количество клеток выражали в относительных (%) и абсолютных (•109/л) величинах. Исследование поглотительной способности нейтрофилов периферической крови проводили на модели поглощения частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза - (%) клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса на один нейтрофил. Генерацию активных форм кислорода нейтрофилами оценивали в тесте восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму диформазан (НСТ-тесте). Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест, с помощью иммерсионной микроскопии определяли активность - процент клеток, восстанавливающих НСТ, и интенсивность НСТ-теста, дифференцируя клетки в зависимости от заполнения площади цитоплазмы. Функциональный резерв нейтрофилов определяли как отношение показателей индуцированного НСТ-теста к спонтанному. Оценку гуморального иммунного ответа проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, в абсолютных величинах и в пересчете на ядросодержащие клетки (ЯСК). Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, наличие связи между показателями исследовали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что при экспериментальном ГПТ в периферической крови изменяется количественный состав лейкоцитов, в относительных величинах увеличивается количество нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, увеличивается количество моноцитов, снижается количество лимфоцитов (табл. 1). Пересчет показателей на абсолютные величины выявил моноцитопению и лимфоцитопению, количество лимфоцитов снижается в среднем на 53% по сравнению с группой контроля (табл. 2). При оценке функциональной активности нейтрофилов - ключевых эффекторов врожденного иммунитета - отмечено увеличение интенсивности спонтанного и индуцированного НСТ-теста соответственно на 50% и 26% от средних величин в контрольной группе. Показатели поглотительной способности фагоцитов - активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число - значимо не изменяются. Исследование адаптивного иммунитета при ГПТ выявило угнетение Th1-зависимого иммунного ответа, оцениваемого по интенсивности реакции ГЗТ, а также Th2-зависимого иммунного ответа при подсчете АОК в селезенке в абсолютных величинах и в пересчете на ЯСК. Полагаем, что депрессия показателей адаптивного иммунитета в определенной мере обусловлена лимфоцитопенией. При проведении корреляционного анализа нами установлена прямая средней силы статистически значимая связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и абсолютным количеством АОК в селезенке (коэффициент корреляции Спирмена R= 0,69; p<0,05) и интенсивностью реакции ГЗТ (коэффициент корреляции Спирмена R= 0,73; p<0,05).

Таблица 1

Влияние амлодипина на количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе в относительных величинах (M±m)

Примечание. Здесь и далее * - статистически значимые (р<0,05) различия с группой 1, ** - с группой 2.

Таблица 2

Влияние амлодипина на количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе в абсолютных величинах (M±m)

Эффект ПТГ на иммунокомпетентные клетки и формирование иммунного статуса при гиперпаратиреозе могут быть связаны с прямым и опосредованным действием. Установлено, что 2-й тип рецептора к ПТГ (PTH2R) экспрессируется на гранулоцитах и в меньшей степени - на моноцитах и лимфоцитах [9]. В литературе отсутствует единое мнение о векторе изменений определенных функций фагоцитов при ХПН в связи с повышением концентрации ПТГ при вторичном гиперпаратиреозе: исследователи констатируют повышение, снижение или отсутствие изменений адгезии, хемотаксиса, поглотительной и киллинговой способностей. Активация фагоцитов в периферической крови при гиперпаратиреозе может быть связана с повышением внутриклеточной концентрации Ca2+ и сопутствующими изменениями активности внутриклеточных мессенджеров (аденилатциклазы, активация кальцийзависимых мессенджеров - транскрипционных факторов Spi1/PU.1, AP-1/FOS и последующая активация семейства генов кальгранулинов S100-S100A8 и S100A9, генов CCL2 /MCP-1, CD14, FOLR2), интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и иными факторами [8]. Большинство исследователей констатируют связь вторичного ГПТ при ХПН с дисфункцией Т- и В-звена иммунитета, прежде всего из-за повышения базального уровня цитозольного кальция [10]. Показательно, что паратиреоидэктомия часто приводит к восстановлению иммунного статуса и нивелированию клинических эквивалентов иммунодефицита.

Применение амлодипина при экспериментальном ГПТ приводит к изменению количественного представительства лейкоцитов в периферической крови. Так, в относительных величинах полностью восстанавливается количество нейтрофилов, лимфоцитов, увеличивается количество моноцитов (табл. 1). При пересчете показателей на абсолютные величины обнаружено восстановление количества лимфоцитов и моноцитов в крови (табл. 2). В условиях применения амлодипина изменяется функциональная активность нейтрофилов в крови (табл. 3). Увеличиваются интенсивность фагоцитоза (в среднем на 48% от значений в контрольной группе) и фагоцитарное число (в среднем на 18%). Амлодипин изменяет показатели генерации активных форм кислорода нейтрофилами - повышается активность спонтанного НСТ-теста, снижается функциональный резерв нейтрофилов, оцениваемый по активности НСТ-теста. Применение амлодипина приводит к увеличению показателей адаптивного иммунитета - восстанавливаются интенсивность реакции ГЗТ и количество АОК в селезенке в пересчете на ЯСК (табл. 4).

Таблица 3

Влияние амлодипина на показатели врожденного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M±m)

Таблица 4

Влияние амлодипина на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M±m)

По данным других исследователей, применение при ГПТ таких блокаторов кальциевых каналов, как верапамил, нифедипин, амлодипин и иные, нормализует содержание кальция, АТФ и углеводов в цитоплазме, но только частично восстанавливает функцию фагоцитов [8].

Выводы

1.        При экспериментальном индуцированном диетой гиперпаратиреозе развиваются лимфоцитопения, активация генерации активных форм кислорода нейтрофилами и угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа. Угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере снижения количества лимфоцитов в крови.

2.        Применение блокатора кальциевых каналов амлодипина в суммарной дозе 1,75 мг/кг при экспериментальном гиперпаратиреозе приводит к восстановлению количества лимфоцитов в крови и показателей Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа, активации поглотительной способности и снижению функционального резерва генерации активных форм кислорода нейтрофилами.

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                   г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                    г. Челябинск.

Библиографическая ссылка