Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Добрыня Ю.М. 1 Аванесян С.С. 1 Бондарева Н.И. 1 Тимченко Л.Д. 1 Ржепаковский И.В. 1 Симечёва Е.И. 1

---

1 ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»

На основании анализа литературных источников выявлено, что в настоящее время представляется актуальным поиск микроорганизмов продуцентов ферментов, в том числе амилазы. Одним из перспективных в этом плане биообъектов является природный микробный симбионт Medusomyces gisevii (чайный гриб), который благодаря неидентичности микробиологического состава и различным условиям выращивания может иметь различный компонентный состав метаболитов. Проведены исследования амилолитической активности культуральной жидкости Medusomyces gisevii на 10-е, 20-е и 30-е сутки культивирования. Выращивание гриба осуществлялось в лабораторных условиях по классической методике. Установлено, что данный микроорганизм начинает проявлять амилолитическую активность уже на 10-е сутки культивирования в стандартной питательной среде и сохраняет ее на всем протяжении эксперимента (30 суток). С течением времени амилолитическая активность повышается. Однако интенсивность метаболизма микроорганизмов, критерием которой является соотношение общей и экзогенной амилазы, наиболее выражена на ранних сроках культивации.

Статья в формате PDF

132 KB

амилаза

культуральная жидкость

чайный гриб

симбионт Medusomyces gisevii

1. Бруслик Н.Л. Сравнительная характеристика амилолитической активности грамположительных бактерий / Н.Л. Бруслик, А.Р. Каюмов, М.И. Богачев, Д.Р. Яруллина // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация – 2014 – № 2 – С. 47–51.

2. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов / И.П. Галич – Киев: Наукова думка, 2000 – 195 с.

3. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева – М.: Агропромиздат, 2008. – 358 с.

4. Даниелян Л.Т. Чайный гриб (Kombucha) и его биологические особенности / Л.Т. Даниелян – М.: Медицина, 2005. — 176 с.

5. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии / В.Г. Колб, В.С. Камышников – Минск: Беларусь, 1982. – 234 с.

6. Костылева Е.В. Разработка биотехнологического процесса получения комплексных ферментных препаратов термостабильной α-амилазы и протеазы на основе нового мутантного штамма Bacilluslicheniformis: дис … канд. техн. наук: 05.18.07 / Костылева Елена Викторовна. – М., 2003 – 157 с.

Биокатализаторы использовались человеком на протяжении многих веков, и на сегодняшний день количество ферментов, применяемых в различных сферах жизни, постоянно растет. В настоящее время актуальным является поиск наиболее перспективных способов получения ферментов, так как производство препаратов на их основе занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии, а объемы продукции постоянно увеличиваются [3]. Столь широкое применение ферментов связано с их биологической ролью – способностью во много раз увеличивать скорость химических реакций, а также чрезвычайно высокой специфичностью по отношению к определенным веществам и типам реакций.

Достаточно широко и успешно применяются амилазы, которые делятся на альфа-, бета- и гамма-амилазу, что связано с их распространением в природе, а также с особой специфичностью по отношению к субстрату.

Существенна роль амилаз в живом организме. Данные ферменты относятся к классу гликозил-гидролаз и катализируют гидролиз крахмала, гликогена и родственных полисахаридов и олигосахаридов с образованием моносахаридов, играя, по нашему мнению, существенную роль в обеспечении механизма пребиотического действия. Амилазная активность микроорганизмов — симбионтов организма человека может иметь клиническое значение в таких процессах, как, например, гидролиз крахмала кишечной микрофлорой или ингибирование образования биопленок у патогенных бактерий [1].

Механизм действия амилаз обусловливает их применение в областях производства, использующих крахмалосодержащее сырье. К ним относится медицинская, текстильная, мясомолочная, спиртовая промышленность, тонкие химические технологии, пивоварение, хлебопечение, производство детергентов, кормовых добавок в сельском хозяйстве, переработка отходов мясной и птицеперерабатывающей промышленности [6].

В период, предшествующий интенсивному развитию ферментной промышленности, главнейшим источником амилазы в странах Европы был солод. Из животного сырья получали амилазы, применяющиеся в медицинских целях [3]. Общепринято, что одним из главных источников амилаз являются микроорганизмы. Для получения промышленных препаратов амилазы используют грибы – Aspergillus oryzae, Aspergillus niger и Aspergillus wentii. Среди бактерий к активным продуцентам амилаз относятся некоторые бациллы (Bacillus macerans, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis), псевдомонады и различные виды стрептомицетов. Амилаза, выделяемая из культуры Bacillus stearothermophilus, не утрачивает своей активности даже при кратковременном нагревании до 1000С. Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces [2].

На сегодняшний день не утрачивает актуальности изыскание новых микроорганизмов — продуцентов амилазы. По нашему мнению, в качестве приоритетных в этом плане могут выступать природные микробные симбионты, обладающие высокой ферментативной активностью. Одним из таких объектов является природный симбионт Medusomyces gisevii (чайный гриб), который представляет собой сложную микробную ассоциацию в виде массы (зооглеи) на поверхности жидкости и пылевидного осадка на дне сосуда [4]. Достоверно известно, что в состав симбиоза входит несколько видов уксуснокислых бактерий и дрожжей, однако многие авторы при описании этого организма отмечают неидентичность микробиологического состава образцов, отобранных из различных регионов культивирования. Этот факт в совокупности с неидентичностью воспроизведения условий выращивания может приводить к различному компонентному составу метаболитов чайного гриба. В литературных источниках имеются упоминания о содержании в культуральной жидкости чайного гриба фермента амилазы, но данные эти единичны и не содержат сведений о количестве этого фермента на разных этапах культивирования.

Цель работы

В связи с вышеизложенным целью исследования явилось изучение динамики проявления амилолитической активности культуральной жидкости чайного гриба при выращивании его в условиях проблемной научно-исследовательской лаборатории «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» ЦКП Северо-Кавказского Федерального университета.

Материалы и методы исследования

В качестве исследуемого объекта выступала культуральная жидкость Medusomyces gisevii (чайный гриб), отобранная на разных этапах культивирования (10-е, 20-е и 30-е сутки), которое осуществляли в течение месяца при комнатной температуре по классической методике на питательной среде, состоящей из кипяченой водопроводной воды, сахарозы (10%), экстракта черного чая (0,1%).

Маркером интенсивности метаболизма бактериальных клеток, входящих в симбионт, послужило количество общей амилазы в нативной культуральной жидкости, содержащей, кроме жидкой части, фрагменты волокон гриба и микроорганизмы. Однако на практике в биотехнологических и медицинских целях не исключено использование свободного от различных примесей культурального фильтрата исследуемой субстанции. Кроме того, соотношение количества амилазы (общей) в нефильтрованной культуральной жидкости к данному показателю в фильтрате, по нашему мнению, в той или иной мере отражает интенсивность экзогенной метаболической активности микроорганизмов-продуцентов, что характеризует их биотехнологический потенциал.

В связи с вышеизложенным каждая проба культуральной жидкости подразделялась на 2 части. Одна часть подвергалась ультрамикрофильтрации через фильтр 0,22 мкм с целью освобождения исследуемого субстрата от присутствия в нем крупных примесей, нитей и микроорганизмов. Вторая часть пробы фильтрации не подвергалась. Все исследования проводились в десятикратном повторе.

Для определения амилолитической активности использовали метод Каравея [5] в нашей модификации. Принцип метода основан на колориметрическом определении концентрации амилодекстрина по степени интенсивности реакции с йодом и длине волны 650 нм до и после ферментативного гидролиза крахмала амилазой, содержащейся в культуральной среде. При этом нами были определены экспериментальным путем соотношения субстрата и ферментной составляющей. За единицу активности фермента принимали его количество, содержащееся в 1 мл исследуемого биологического раствора, которое расщепляет амилодекстрин (в мкг) за 1 мин при 37°С.

Удельную амилолитическую активность в пробах вычисляли по формуле:

Х= ,

где Х – удельная амилолитическая активность ферментного препарата культуральной жидкости чайного гриба (мкг/мин×мл); Дк – оптическая плотность контрольного раствора (нм); Дп – оптическая плотность опытного образца (нм); t – время инкубации фермент-субстратной смеси (мин); V – объем пробы (мл).

Результаты исследований

Результаты исследования, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что культуральная жидкость чайного гриба проявляет амилолитическую активность, которая закономерно возрастает с 10-х по 30-е сутки культивирования до 167,8±3,1мкг/мин×мл.

Таблица 1

Средние показатели амилолитической активности культуральной жидкости чайного гриба на разные сутки культивирования, (М±m)*

*достоверность по тексту.

При этом амилаза, содержащаяся в фильтрате, составляла 58,88 %, 52,08% и 47,73% соответственно на 10-е, 20-е, 30-е сутки культивирования от количества общей амилазы, находящейся в нефильтрованной культуральной среде (при Р ≤0,05).

Заключение

Амилолитическая активность культуральной жидкости сохраняется на протяжении всего периода исследования (30 суток). При этом часть фермента адсорбируется на плотных составных компонентах субстанции, однако практически 50% амилазы сохраняется и в фильтрате. Указанные результаты позволяют рассматривать обе исследуемые субстанции как перспективное биотехнологическое сырье — источник амилазы.

Интенсивность метаболизма микроорганизмов, критерием которой является соотношение общей и экзогенной амилазы, наиболее выражена на ранних сроках культивации.

Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/2016).

Рецензенты:

Федько Н.А., д.м.н., профессор, декан факультета гуманитарного и медико-биологического образования ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет», 355000, Россия, г. Ставрополь;

Джандарова Т.И., д.б.н., доцент, профессор кафедры анатомии и физиологии ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный университет», г. Ставрополь.

Библиографическая ссылка