В России в структуре онкологической заболеваемости населения в 2013 году рак слизистой оболочки полости рта составляет около 5,5 % [3]. Среди опухолей головы и шеи данная патология занимает второе место, после рака гортани [7]. У мужчин данное заболевание встречается в 4 раза чаще, чем у женщин. Максимальное число заболеваний приходится на возрастную группу 40-60 лет, наиболее трудоспособный возраст [7,1].
Рак орофарингеальной зоны среди причин летальности стоит на 4-ом месте после рака легкого, желудка и колоректальной зоны [7].
В Российской Федерации смертность от рака органов полости рта у мужчин занимает 7 место, в то время как у женщин - 16-е и составили в 2007 году 8,1 и 1,1 на 100 тысяч населения [7,1].
Развитие регионарных метастазов после комбинированного лечения наблюдается у 40-75 % больных, а отдаленное метастазирование выявляется в 15 % [5].
Лечение регионарных метастазов, в большинстве случаев, осуществляется хирургически, но ряд авторов утверждают, что необходимо проводить комбинированное лечение, где первым этапом является лучевая терапия [6].
Следует отметить, что после комбинированного и даже комплексного лечения местные рецидивы у больных раком органов полости рта возникают в 25-40 % [4].
Для опухолевого процесса с распространенностью Т3 3-х и 5-летняя выживаемость равна 27 % и 19 %, в то время как Т4 - 21 % и 13 % [8]. Данные П.Ю. Полякова с соавт. (1997) свидетельствуют, что при IV стадии 3-х летняя выживаемость не зависит от метода лечения и не превышает 10,9 %.
Пятилетняя выживаемость при комбинированном методе лечения у больных с I стадии составила 60-85 %, при II стадии - 50-60 % [9]. Наличие III стадии РОПР дает возможность прогнозировать пятилетнюю безрецидивную выживаемость у больных после комбинированного и комплексного лечения не более чем в 10-12 %. В то время как при IV стадии независимо от методов лечения трехлетняя безрецидивная выживаемость составляет 5,0-10,9 % [6].
Большое значение для прогноза течения рака разных локализаций уделяется исследованиям таких молекулярных маркеров, как: белок Ki 67 (пролиферация) иp53, CD34 (внутриопухолевая микрососудистая плотность). Следует отметить, что в литературе имеются противоречивые сведения в отношении точности прогнозирования этих факторов, поэтому в регулярной практике их использование не рекомендуется [2,10].
Мы не встречали работ, посвященных исследованию данных маркеров у больных раком органов полости рта, что послужило основанием к исследованию новых способов прогнозирования развития регионарных метастазов и рецидивов у больных раком органов полости рта с использованием Ki 67, p53, CD34.
Цель исследования. Изучение экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров (р53, ki-67, CD34) при раке органов полости рта без метастазов, в группе с метастазами и рецидивами и оценка возможности их индивидуального или комплексного использования для прогнозирования течения злокачественного процесса.
Материалы и методы. Объектом исследования были 90 больных РОПР, которые были разделены на 3 группы по 30 человек, первая группа с наличием регионарных метастазов, вторая - без метастазов, третья - с рецидивами, проходивших лечение в отделении опухолей головы и шеи ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ в 2004-2012 гг.
Мужчин было 69, женщин - 21. Возраст больных составлял 36-75 лет. По распространенности процесса: со II стадией (T2N0M0) было 19человек, III - 37 (T2N1M0 - 9, T3N0M0 - 21, T3N1M0 - 7), IV - 34 (T3N2M0 - 5, T4N0M0 - 17, T4N1M0 - 12).
У 73 (81,1 %) больных опухолевым процессом был поражен язык, у 17 (18,9 %) - слизистая дна полости рта. На языке опухоль располагалась чаще на боковой поверхности (54,4 %).
У всех больных был плоскоклеточный рак. Высокая степень дифференцировки (G1) имела место у 24 больных, средняя степень (G2) - 43 и низкая степень (G3) - 23.
Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использовались в работе первичные антитела: антиген ki-67, пролиферативная активность (ядерное окрашивание), нормальный и мутантный тип p53 (ядерное окрашивание), CD34 (мембранное окрашивание эндотелиальных клеток).
Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-LinkThermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 0С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 0С и дальнейшее охлаждение до 65 0С. Затем стекла промывались в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку экспрессии маркеров изучали как минимум на 10 случайно выбранных полях с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40.
В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:
1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по р53, если было окрашено более 25 % ядер опухолевых клеток;
2) для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество ki-67-положительных опухолевых клеток, приходящихся на 200-300 опухолевых клеток.
Маркеры пролиферативной активности расценивались на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности:
0 % - 20 % - низкая пролиферативная активность,
21 % - 50 % - умеренная пролиферативная активность,
51 % - 100 % - высокая пролиферативная активность.
3) Для оценки ангиогенеза в опухолях использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumor microvessel density - MVD), который определяется стандартным иммуногистохимическим методом с использованием эндотелиальных антигенов и позволяет количественно оценить процесс ангиогенеза в опухоли. Микрососуды окрашивали антителом CD34. Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40.
Статистическая обработка осуществлялась программой Statistica 6,0.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведение ИГХ исследования выявило наличие достоверных различий экспрессии опухолевыми клетками Ki-67 и P53 между группами больных раком органов полости рта без метастазов, с метастазами и рецидивами (табл. 1).
Таблица 1
Экспрессия опухолевыми клетками Ki-67 и P53 в исследуемых группах %.
Маркеры пролиферации и апоптоза |
Группа без метастазов |
Группа с метастазами |
Группа с рецидивами |
Ki-67 |
24,3±2,6 |
46,7±4,1* |
27,5±2,9 º |
P53 |
21,2±3,9 |
60,1±3,7* |
33,5±3,6* º |
* - отличия показателей, статистически достоверных по отношению к группе без метастазов (р≤0,05).
º - отличия показателей, статистически достоверных по отношению к группе с метастазами (р≤0,05).
Анализ данных показал, что в группе больных раком органов полости рта с метастазами показатели экспрессии маркера р53 превосходило в 2,8 и 1,8 показатель в группах без метастазов и с рецидивами (р≤0,05). В то время как в группе без метастазов, по сравнению с рецидивной группой, показатели в 1,6 раза были меньше (р<0,05).
Проведенное исследование пролиферативной активности опухолей показали преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группах без метастазов и с рецидивами, в то время как в группе с метастазами преобладали опухоли умеренной пролиферативной активности. Минимальное количество опухолей с высокой ПА выявлено в группе без метастазов, максимальное - в группе с метастазами. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опухолей с высокой ПА в группе без метастазов составило 10, в группе с рецидивами - 5,7, тогда как в группе с метастазами - 1.
Доля пролиферирующих ki-67 положительных клеток в группе без метастазов находилась в пределах от 10 % до 55 % клеток, в группе с метастазами от 20 % до 70 %, в группе с рецидивами от 10 % до 60 %.
Таблица 2
Доля опухолей с различной пролиферативной активностью (ПА) в исследуемых группах
|
Группа без метастазов (n=30) |
Группа с метастазами(n=30) |
Группа с рецидивами(n=30) |
Низкая ПА |
66,7% (n=20) |
20% (n=6) |
56,7% (n=17) |
Умеренная ПА |
26,6% (n=8) |
60% (n=18) |
33,3% (n=10) |
Высокая ПА |
6,7% (n=2) |
20% (n=6) |
10% (n=3) |
Из табл. 2 следует, что в группе с метастазами отмечается максимальный индекс пролиферативной активности, превышающий аналогичный показатель в 1,9 и 1,7 раза в группе без метастазов и с рецидивами (р≤0,05). Однако статистически значимой разницы пролиферативной активности между группами без метастазов и с рецидивами не получено.
Данные, полученные при оценке внутриопухолевой микрососудистой плотности, показали, что метастазирующие опухоли органов полости рта имели наиболее активные процессы пролиферации опухолевых клеток, в группе больных с рецидивами их активность была несколько ниже и регистрировалась не по всем изученным показателям, в опухолях больных без метастазов она была минимальной среди всех исследованных групп. Так, процессы неоангиогенеза имели схожую активность в опухолях больных раком органов полости рта с метастазами и рецидивами и превышали показатели в группе больных без метастазов.
Данные, отражающие экспрессию CD34 на эндотелии микрососудов опухолей полости рта в группах без метастазов, с метастазами и с рецидивами, представлены в табл. 3.
Таблица 3
Сравнительная характеристика внутриопухолевой микрососудистой плотности
Исследуемая группа |
Диаметр капилляра (мкм) |
Среднее количество сосудов в 1 поле зрения |
||
минимальный |
максимальный |
средний (М±m) |
||
Группа без метастазов |
2,3 |
39,4 |
6,6 ± 0,5 |
6,4±0,7 |
Группа с метастазами |
3,6 |
44,5 |
9,2 ± 0,7* |
8,8±0,9* |
Группа с рецидивами |
3,8 |
46,7 |
10,6 ± 0,6 * |
9,7±0,8* |
Примечание:
* - отличия показателей достоверны по отношению к группе без метастазов (Р≤0,05);
• - отличие достоверно по отношению к группе с метастазами (Р≤0,05).
Проведя оценку внутриопухолевой микрососудистой плотности, выявленной нами при иммуногистохимическом исследовании с использованием антител CD34, мы обнаружили, что в группе без метастазов она составила 6,4±0,7 сосуда в 1 поле зрения. В группах с метастазами и рецидивами наиболее выраженные изменения внутриопухолевой микрососудистой плотности, по сравнению с группой без метастазов, соответствовали превышению в 1,4 и 1,5 раза количества окрашенных антителами CD34 сосудов, и равнялось для опухолей данных групп 8,8±0,9 и 9,7±0,8 сосуда в 1 поле зрения.
Несмотря на данные литературы, согласно которым белок Ki 67 и p53 точности прогнозирования не дают [10], по нашему мнению, данные маркеры недооценены и могут быть использованы для прогноза течения заболевания рака органов полости рта, о чем свидетельствуют полученные результаты исследования.
Заключение
- Проведенное исследование показало наиболее значимые показатели экспрессии опухолевыми клетками р53 в группе с метастазами, превосходящее данный показатель в группах без метастазов и с рецидивами в два и более раз (р≤0,05). Исследование пролиферативной активности опухолей групп больных раком органов полости рта с наличием регионарных метастазов, без них и с рецидивами показало преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группах без метастазов и с рецидивами, тогда как в группе с метастазами преобладали опухоли умеренной пролиферативной активности. Таким образом, высокие показатели экспрессии опухолевыми клетками р53, ki-67 могут расцениваться как неблагоприятные прогностические признаки.
- Проведенные иммуногистохимические исследования с использованием эндотелиального антигена у больных раком органов полости рта показали, что преобладание сосудов крупного диаметра с утолщенной стенкой может быть связано с наличием или возможным развитием метастазов и рецидивов, являясь неблагоприятным предиктором заболевания.
Рецензенты:
Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;
Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.
Библиографическая ссылка
Светицкий П.В., Новикова И.А., Нистратов Г.П., Аединова И.В., Волкова В.Л., Баужадзе М.В., Ульянова Е.П. НЕКОТОРЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ (Р53, KI-67, CD34) ПРИ РАКЕ ОРГАНОВ ПОЛОСТИ РТА // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2-1. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=17445 (дата обращения: 24.04.2024).