Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Левичкин В.Д. 1 Трофименко А.И. 1 Каде А.Х. 1 Павлюченко И.И. 1 Мясникова В.В. 1 Пирогова Н.П. 1 Занин С.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Целью работы было исследование цитокинового статуса и показателей системы про-/антиоксиданты в динамике острой локальной церебральной ишемии в эксперименте у крыс. Определяли общую антиоксидантную активность, уровень максимальной вспышки хемилюминесценции кров и активность супероксиддисмутазы и каталазы на 1, 3, 7, 14 сутки. Цитокиновый статус оценивали по уровню провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОα). В ходе работы показано значительное превалирование на всех этапах наблюдения прооксидантных факторов над антиоксидантными. Указанные изменения ассоциировались со значительным повышением уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОα) в крови. Таким образом, резкое снижение общей АОА плазмы и стойкое повышение уровня продуктов СРО дает повод говорить о дисбалансе в системе АОЗ крови и организма в целом, что является неблагоприятным фактором течения патологического процесса и требует эффективных мер метаболической коррекции.

Статья в формате PDF

140 KB

оксидативный стресс.

интерлейкин-6

интерлейкин-1

инсульт

1. Луговая И.А. Активность ферментов антирадикальной защиты в эритроцитах и в раневом отделяемом у больных с осложненным течением сахарного диабета / И.А. Луговая, И.И. Павлюченко, С.Р. Федосов // Открытое образование. – 2006. – № 3. – С. 425–427.

2. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него // Биохимия.— 2001.— Т. 66, вып. 5.— С. 592–609.

3. Трофименко А.И. Моделирование церебральной ишемии посредством коагуляции средней мозговой артерии у крыс / А. И. Трофименко, А. Х. Каде, В. П. Лебедев [и соавт.] // Фундаментальные исследования. - №2. – 2012. – с. 215-218.

4. Трофименко А.И. Характеристика сдвигов в системе про-/антиоксиданты у крыс с моделью острой локальной церебральной ишемии / А.И. Трофименко, В.Д. Левичкин, И.И. Павлюченко, А. Х. Каде, О. С. Охременко, С. А. Занин // Фундаментальные исследования. – 2013. - № 9 (ч.4). – С. 683-686.

5. Трофименко А.И. Активность свободно-радикального окисления и эндорфинергической системы у крыс с моделью острой локальной церебральной ишемии / А. И. Трофименко, В. Д. Левичкин, И. И. Павлюченко, А. Х. Каде, О. С. Охременко, Ф. А. Нехай, С. А. Занин // Современные наукоемкие технологии. - 2014. - № 4. - С. 126-127.

6. Трофименко А.И. Динамика цитокинового статуса у крыс при моделировании ишемического инсульта / А.И. Трофименко, А.Х. Каде, В.Д. Левичкин [и соавт.] // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 2. - С. 326.

7. Трофименко А.И. Про-/антиоксидантная активность плазмы крови у крыс с моделью острой локальной церебральной ишемии / А.И. Трофименко, В.Д. Левичкин, И.И. Павлюченко [и др.] // Современные наукоемкие технологии. - 2014. - № 4. – С. 142-143.

В связи с вышеизложенным целью исследования является изучение взаимосвязи содержания провоспалительных цитокинов с характером сдвигов в системе про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом.

Материалы и методы. Исследования проведены в лабораториях кафедры общей и клинической патофизиологии и кафедры фундаментальной и клинической биохимии ГБОУ ВПО КубГМУ. Иммуноферментные исследования (ИФА) проводили на базе ЦНИЛ ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России. Эксперименты проведены на 60 белых нелинейных самцах крыс, средней массой - 200±25 гр. Содержание животных и постановка экспериментов проводилась в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 года и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 года, а также международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».

Крысы были разделены на 2 группы: 1 группа - из 20 крыс, контрольная, интактные животные; 2 группа - из 40 крыс, у которых проводилось моделирование экспериментального ишемического инсульта с эвтаназией на 1, 3, 7 и 14 сутки [3]. Все потенциально болезненные вмешательства в проводимых экспериментах, а также эвтаназия осуществлялись под комбинированным инъекционным наркозом [4]. Выделение головного мозга проводили с последующей фиксацией в 10% нейтральном формалине. Для изучения показателей системы прооксиданты-антиоксиданты и уровня провоспалительных цитокинов крысы из группы №2 (n=40) на 1, 3, 7 и 14 выводились из эксперимента по 10 животных, с одномоментным забором крови. В плазме крови определяли уровень ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α методом иммуноферментного анализа (ИФА). Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации показателей проводили на фотометре вертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7. В эритроцитарной массе изучалась активность ферментов антиоксидантной системы (АОС) крови - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ). Активность СОД определяли в гемолизате эритроцитов по методу предложенному В.А. Костюк и соавт. (1990) в авторской модификации И.И. Павлюченко и соавт. (2006) [4, 5, 7], которая основана на способности СОД ингибировать индуцированную реакцию аутоокисления кверцетина. Активность КАТ исследовали в гемолизате эритроцитов по методу R. Beers et al., (1952) в авторской модификации И.И. Павлюченко и соавт. (2006) [4, 5, 7], основанному на оценке скорости убыли субстрата фермента (перекиси водорода). В плазме крови биофизическими методами изучались общая антиоксидантная активность (АОА) и уровень максимальной вспышки хемилюминесценции (МХВЛ).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами непараметрической статистики с использованием программного обеспечения «Statistika 6.0 for Windows» фирмы «Stat Soft Inc.». Полученные результаты выражали в виде средних значений (M) и ошибки среднего (m).

Сравнение выборок проводилось по непараметрическому критерию Манна-Уитни, с установлением уровня значимости *p≤0,05. Величины средних значений в таблицах указаны в границах M±m.

Результаты исследования и их обсуждение. При изучения показателей системы про-/ антиоксиданты были выявлены существенные сдвиги в системе АОЗ крови уже на 1 сутки (табл.1).

Таблица 1

Показатели системы про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом

1АОА- антиоксидантная активность; 2МВХЛ- максимальная вспышка хемилюминесценции;

3КАТ- каталаза; 4СОД- супероксиддисмутаза.

АОА плазмы крови во 2 группе животных на 1 сутки моделирования ИИ достоверно (p≤0,05) возросла в среднем на 49,2% относительно показателей контрольной группы животных, что отражает напряжение в системе АОЗ в ответ на ОС при экспериментальном ишемическом инсульте (табл. 1).

На выраженность оксидативной нагрузки указывает показатель ХЛ, отражающий накопление продуктов свободно-радикального окисления (СРО) в биологических жидкостях и тканях организма.

Уровень ХЛ на 1 сутки после моделирования ИИ в группе 2 был достоверно (p≤0,05) выше значений контрольной группы животных на 138,9% (табл. 2).

Таблица 2

Динамика уровня ИЛ-1β у крыс с экспериментальным

ишемическим инсультом

Примечание: ИЛ-1β - интерлейкин-1β; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.

При изучении активности СОД и КАТ в крови подтвердилось наличие значительного дисбаланса в системе АОЗ организма при развитии ИИ. Активность СОД при моделировании ИИ уже на 1 сутки эксперимента достоверно (p≤0,05) возросла во 2 группе, относительно группы контроля, на 38,5% (табл. 1). В 1 сутки, после моделирования ИИ, активность КАТ была достоверно (p≤0,05) ниже контрольных значений у животных 2 группы на 28,5% (табл. 1). У крыс группы 2 на 1 сутки после моделирования ИИ содержание ИЛ-1β в плазме крови достоверно (р≤0,05) выросло на 93,34% по сравнению с интактными животными группы (табл. 2). В 1 сутки после моделирования ИИ содержание ФНО-α в плазме крови животных группы 2 составило 17,82±6,31 пг/мл, что было достоверно (р≤0,05) больше на 52,80 %, чем в плазме крови интактных животных (табл. 3).

Таблица 3

Динамика уровня ФНО-α у крыс с экспериментальным

ишемическим инсультом

Примечание: ФНО-α - фактор некроза опухоли-α; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.

У животных группы 2 уровень ИЛ-6 в 1 сутки достоверно (<0,05) повышался на 111,9% (табл. 4).

Таблица 4

Динамика уровня ИЛ-6 у животных с экспериментальным

ишемическим инсультом

Примечание: ИЛ-6 - интерлейкин-6; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.

На 3 сутки у животных 2 группы показатель АОА был достоверно (p≤0,05) выше контрольных значений в среднем на 103,3% и такое повышение данного биофизического показателя сохранялось вплоть до 7 суток (табл. 1).

Интенсивность прооксидантной нагрузки на 3 сутки достоверно (p≤0,05) возрастала. Показатель МХВЛ плазмы крови в этот период во 2 группе был достоверно (p≤0,05) выше показателя контроля на 288,3%  (табл. 1).

На 3 сутки показатель активности СОД достоверно (p≤0,05) увеличивался во 2 группе, относительно контрольных значений на 61,5% (табл. 1).

Активность КАТ была достоверно (p≤0,05) ниже контрольных значений у животных 2 группы на 3 сутки - на 51,4% (табл. 1).

Эти сдвиги свидетельствуют о максимальном напряжении системы АОЗ в этот период у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом.

К 3 суткам уровень ИЛ-1β достоверно (р≤0,05) увеличился еще на 74,17% (табл. 2).

Значительное стойкое повышение уровня ИЛ-6 имело место в дальнейшем в течение всего периода наблюдения (табл. 2).

Уровень ФНО-α после моделирования ИИ у животных группы 2 оставался достоверно (р≤0,05) повышенным без существенной динамики от 3 до 14 суток, что может объяснить большую активность процессов свободно-радикального окисления у крыс с данной моделью патологии [10, 12-14] (табл. 3).

У животных группы 2 уровень ИЛ-6 достоверно (р≤0,05) достигал максимума к 3 суткам, повышаясь на 50,9% по сравнению с 1 сутками.

Повышение АОА, наблюдаемое на 3 сутки, сохранялось вплоть до 7 суток (табл. 1).

На 7 сутки отмечен максимальный подъем уровня продуктов СРО в плазме крови экспериментальных животных, что выразилось в достоверном (p≤0,05) повышении показателя МХВЛ во 2 группе животных на 166,7% по сравнению с 3 сутками (табл. 1).

Происходило дальнейшее возрастание напряжения в системе АОЗ. На 7 сутки показатель активности СОД достоверно (p≤0,05) увеличивался во 2 группе животных, относительно контрольных значений, на 153,8% (табл. 1).

На 7 сутки после моделирования ИИ содержание ИЛ-1β достоверно (р≤0,05) снизилось на 65,36% по сравнению с 3 сутками(табл. 2).

На 7 сутки после моделирования ИИ содержание ФНО-α в плазме крови животных группы 2 оставалось достоверно (р≤0,05) больше на 52,8%, чем в плазме крови интактных животных (табл. 3).

ИЛ-6 был достоверно (р≤0,05) стойко повышен в течение всего периода наблюдения (табл. 4).

На 14 сутки наблюдения отмечено резкое снижение АОА плазмы крови, при этом во 2 группе происходил обвал этого показателя ниже контрольных значений на 16% (p≤0,05) (табл. 1). Данная динамика показателей АОА плазмы крови у животных с экспериментальным ишемическим инсультом свидетельствует о выраженном ОС, который прогрессировал во времени.

К 14 суткам отмечено достоверное (p≤0,05) снижение уровня МХВЛ плазмы крови относительно 7 суток, но уровень этого показателя прооксидантной нагрузки оставался высоким и в этот период. Он достоверно (p≤0,05) превышал уровень, отмеченный во 2 группе в 1 сутки на 107,9% (табл. 1) Данный факт является подтверждением выраженных метаболических сдвигов в организме при возникновении ишемических катастроф в мозговых тканях.

На 14 сутки после моделирования ИИ уровень ИЛ-1β в плазме крови животных группы 2 вернулся к уровню 1 суток. Однако оставался достоверно (р≤0,05) выше на 93,34 % по сравнению с интактными животными (табл. 1). Уровни ФНО-α и ИЛ-6 оставались повышенными также и на 7 сутки (табл. 3, 4).

Таким образом, резкое снижение общей АОА плазмы и стойкое повышение уровня продуктов СРО дает повод говорить о дисбалансе в системе АОЗ крови и организма в целом, что является неблагоприятным фактором течения патологического процесса и требует эффективных мер метаболической коррекции. Дисбаланс в системе АОЗ клеток подтверждается и динамикой изменения активности ферментов антирадикальной и антиоксидантной защиты. Кроме того, есть проблема избыточного образования активных метаболитов кислорода при участии компонентов АОС, в частности, пероксида водорода, который может синтезироваться в повышенных количествах на фоне высокой активности СОД и низкой активности КАТ, что и наблюдалось у экспериментальных животных.

Развитие экспериментального ишемического инсульта сопровождалось одновременным значительным ростом содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) в периферической крови. Синтез ИЛ-1 микроглией в ответ на развитие церебральной ишемии является активирующим сигналом для запуска образования других провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-α), а также стимуляции астроцитов к продукции потенциальных нейротоксичных веществ, провоспалительные цитокины, АФК и метаболиты арахидоновой кислоты [6]. ФНО-α оказывает токсическое действие на нейроны путем активации системы генерации активных форм кислорода (АФК), что резко индуцирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), в том числе, за счет взаимодействия с сигнальной системой сфингомиелинового цикла [6].

ИЛ-1 и ФНО-α являются мощными индукторами ИЛ-6-синтетазы в астроцитах: быстрое увеличение содержания микроглиального ИЛ-1β в первые 1-2 ч церебральной ишемии вызывает усиленный синтез ИЛ-6 [6].

Колесникова Н.В., д.б.н., профессор, заведующая ЦНИЛ Отдела клинической экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, г. Краснодар;

Абушкевич В.Г., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России» г. Краснодар.

Библиографическая ссылка