В настоящее время трансплантация костного мозга находит все более широкое применение и является одним из высокотехнологичных методов терапии, как за рубежом, так и в нашей стране при лечении онкогематологических, генерализованных аутоиммунных заболеваний, иммунодефицитных состояний.
Общеизвестно, для проведения пересадки костного мозга выбор родственного донора (ГСК) гемопоэтических стволовых клеток существенно ограничен и антигены в распределении по системе HLA-аллелей значительно различается у представителей этнических народов и национальностей.
Однако далеко не для всех этнических народов можно найти совместимого донора гемопоэтических стволовых клеток в Европейских и Американских регистрах, что потребовало создания собственного регистра доноров костного мозга, например, Китая, Японии [1].
Поскольку HLA-антигены являются признанными иммуногенетическими маркерами многих заболеваний и генетические показатели критериев предрасположенности к онкозаболеваниям, выявление факторов, влияющих на течение болезни и прогноз, является актуальной задачей современной медицинской науки.
В работе [6] описано заболевание с формированием тяжелых цепей иммуноглобулинов, по клинической картине напоминает лимфому. Болеют обычно мужчины, пик заболеваемости приходится на период с 60 до70 лет. Первыми проявлениями служит увеличение лимфатических
узлов, лихорадка и анемия. В костном мозге обнаруживаются лимфоциты в сочетании с плазматическими клетками, нередко наблюдается эозинофилия, при электрофорезе белков сыворотки обнаруживают М-градиент в зоне a или b-глобулинов.
В связи с чем на основе этих данных и возможности скрытого течения подобных заболеваний важно учитывать при планировании неродственной трансплантации и для качественной пересадки костного мозга, где потенциальным донорам, необходимо проводить исследования на изотипы тяжёлых и легких цепей иммуноглобулинов с профилактической целью.
Общеизвестно, что одним из основных факторов неблагоприятного прогноза основного заболевания является присоединение инфекций. Инфекции играют ключевую роль в развитии целого ряда заболеваний, и представляет актуальным изучить распространенность герпес - вирусных инфекций, в частности, обусловленных вирусом Эпштейна-Барр и цитомегаловирусом.
Выполнение трансплантации костного мозга требует строгого соблюдения стандартов безопасности в соответствии с государственными нормативными документами, регламентирующий деятельность центра единого Республиканского регистра типирования доноров костного мозга, где проводится необходимый перечень исследований с помощью специфичных и высокотехнологичных методов лабораторной диагностики [3]. В этой связи актуальной задачей для получения мониторинговых данных необходимо создать современные информационные тесты с получением достоверных сведений и изучить современные особенности состояния доноров при подготовке их к планированию близкородственной, неродственной трансплантации костного мозга.
При этом следует учитывать, что информация о частоте встречаемости антигенов в системе HLA–аллелей, содержание свободных цепей иммуноглобулинов и распространенности носительства герпес-вирусной инфекции среди различных этнических популяций и национальностей скудна и противоречива.
Целью нашего исследования явилось изучение иммуногенетических характеристик и распространенности носительства вирусов Эпштейна–Барр и цитомегаловируса среди здорового населения – потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток киргизской национальности.
Материалы и методы исследования
В группу исследования вошли 127 здоровых потенциальных доноров киргизской национальности из Национального Регистра гемопоэтических стволовых клеток Киргизии в Санкт-Петербурге для изучения иммунологических и популяционных характеристик, типирование проводилось в
лаборатории иммуногематологии Российского НИИ гематологии и трансфузиологии с1998 по 2009 годы по системе HLA–аллелей I класса локусов (А и В), из них 78 донорам по антигенамHLA – аллелей II класса локуса DRB1*, в возрасте от18 до 45 лет.
Полученные данные сопоставлялись с контрольной группой – 4232 донорами из Российского регистра костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии [5].
А также 78 здоровых доноров киргизской национальности исследованы на носительство вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса в лаборатории молекулярной микробиологии Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Л. Пастера. Контрольную группу составили 79 здоровых жителей Северо-западного региона Российской Федерации.
Типированы 78 здоровых доноров в лаборатории гибридомной технологии ЦНИРРИ на изотипы тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов [2].
Типирование HLA- антигенов I-класса:
Определение HLA-А и В фенотипа обследуемых лиц проводили серологическим методом с использованием панели гистотипирующих антилейкоцитарных сывороток Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, позволяющих определить17антигенов локуса А и 27 антигенов локуса В с помощью двухэтапного лимфоцитотоксического комплемент-опосредованного теста (ФримельХ.,1979).
Типирование HLA-антигенов II-класса:
Молекулярное типирование HLA- генов локуса DRB1* проводили методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР), с использованием набора отечественных праймеров фирмы «ДНК-технология» (Москва), позволяющего выделять 13 групп аллелей HLA-DRB1 базовое разрешение. Геномную ДНК выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (свежей или замороженной при – 20º), стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия (конечная концентрация антикоагулянта 0,5%), с помощью набора реагентов «НПФ ДНК-Технология» Москва или иммуномагнитным методом с использованием реагентов фирмы «Dynal». Все этапы амплификации проводили на амплификаторе «ТЕРЦИК»«ДНК-Технология», Москва). Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в 3,2% агарном геле с визуализацией в ультрафиолетовом свете λ=320 nm. Специфичность продукта амплификации учитывали, используя стандартный маркер длин ДНК PUC-09.
Типирование иммуноглобулинов:
Выполнено методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа. Парапротеины были иммобилизованы на твердой фазе из сывороток, разведенных 1:105 и 1:106 на 0,1 м карбонат-бикарбонатном буфере pH-9,5. Изотипы тяжелых цепей и типы легких цепей миеломных иммуноглобулинов определяли при помощи конъюгатов моноклональных антител (МКАТ) с пероксидазой хрена [4].
Определение вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса:
Исследование в плазме крови вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса методом (ПЦР) полимеразой цепной реакцией при диагностике использовались «АмплиСенстм» ПЦР тест-системы производства ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (лицензия №15/002-Л/02) Минпромнауки и технологии РФ на производство иммунобиологических препаратов. Типирование проводилось методом полимеразной цепной реакцией в лаборатории молекулярной биологии ФБУН НИИЭМ имени Пастера г. Санкт- Петербург.
Статистическая обработка полученных результатов включала в себя анализ стандартных критериев X2-квадрат, который использовали для оценки достоверности различий встречаемости определенных признаков между контрольной группой и исследуемой группой. Определение величины "р", соответствующей найденному значению. X2-квадрат проводили с учетом одной степени свободы.
Статистический анализ полученных исследований проводили с использованием пакета прикладных программ для Электронных Таблиц – " Microsoft - ExcelM Версия 7,0 для Windows 95, для Windows-2010, Statistica-5.
Результаты и их обсуждение
Проведённые нами исследования среди небольшой группы добровольных потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток киргизской национальности в сопоставлении со здоровыми донорами жителей Северо-западного региона Российской Федерации из Российского регистра костного мозга [5], по результатам данных выявлены существенные различия по частоте встречаемости антигенов HLA-аллелей I и II классов.
Таблица 1
Частота встречаемости антигенов HLA-аллелей I класса у здоровых доноров киргизской национальности и здоровых жителей Северо-западного региона Российской Федерации из Российского регистра доноров костного мозга
|
HLA A и В |
Российский Регистр доноров костного мозга п = 4232 |
доноры киргизской национальности п =127 |
|
А11 |
11,6% |
28,6%*** |
|
А24 |
20,9% |
53,1%*** |
|
А26 |
10,1% |
20,4%** |
|
B37 |
1,3% |
8,2%*** |
|
B48 |
0,0% |
4,1%*** |
|
B51 |
9,3% |
30,6%*** |
|
B57 |
4,5% |
26,5%*** |
|
B63 |
0,2% |
2,0%*** |
Примечание. ** — p< 0,05, *** — p<0,001
Из таблицы 1 видно, что для здоровой киргизской популяции характерна более высокая частота встречаемости в крови аллелей HLA-А24, HLA-А11, HLA -А26, HLA-В51,HLA -В37, HLA-В48 и HLA–В57, HLA–В63. При этом аллели HLA-В37, HLA-В48 и HLA-В63 крайне редки в группе сравнения.
Рис. 1. Сравнительный анализ частоты встречаемости антигенов HLA- локуса DRB1* II класса здоровых доноров киргизской национальности и здоровых жителей Северо-западного региона Российской Федерации из Российского регистра доноров костного мозга
По результатам нашего исследования, при сопоставлении частоты встречаемости антигенов HLA-аллелей локуса DRB1* II класса у здоровых доноров киргизской национальности и здоровых жителей Северо-западного региона Российской Федерации из Российского регистра доноров костного мозга представлены на рисунке 1. Показано, что у здоровых доноров киргизской национальности реже выявляется ген HLA-DRB1*10, практически в единичных случаях встречается ген HLA-DRB1*03 и наиболее распространенный гены HLA-DRB1*14, HLA-DRB1*09 и имеются статистически высоко достоверные различия p<0,001.
Следует отметить, что по значимости антигены HLA-DRB1* 04, HLA-DRB1* 15, HLA-DRB1* 11, HLA- DRB1* 16 для здоровой популяции киргизской национальности является редкостью.
Таблица 2
Содержание свободных цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови у здоровых доноров киргизской национальности
|
доноры п =78 |
k-цепи (N=6-13мк/мл) |
l-цепи (N=0,2-1,3мк/мл) |
повышенное содержание Ig |
пол |
возраст |
|
1 |
|
2,0 |
А |
м |
29 |
|
2 |
|
1,4 |
G |
м |
36 |
|
3. |
16 |
|
G |
м |
34 |
|
4 |
19 |
|
А |
м |
45 |
Нами также исследованы 78 здоровых потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток киргизской национальности, считающие себя практически здоровыми людьми, на содержание свободных цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови. Были выявлены в возрасте от 29 – 45 лет повышенные титры иммуноглобулинов типа Ig A k иl цепями – у 2-х мужчин и Ig G k и l цепями – у 2-х мужчин. Дополнительно на местах донорам проведены общепринятые клинические исследования: общий анализ крови с подсчетом тромбоцитов, общий анализ мочи, общий белок и ее фракции, рентгенография черепа, печеночные тесты, трансаминазы (АЛТ, АСТ), а также на вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус и на инфекции Helicobacter pylori. Установлено, что у 2-х мужчин с высокими титрами иммуноглобулинов типа Ig A и Ig G k и l цепями были обнаружены повышенные титры трансаминаз, положительные результаты на инфекции Helicobacter pylori и на вирус Эпштейна – Барр. При этом в анамнезе у двух доноров выявлен хронический энтероколит и ранее перенесший в детстве вирусный гепатит. Все четверо на момент обследования страдали хроническим пиелонефритом и в общем анализе мочи были обнаружены следы белка.
Исходя из этого можно сказать, что среди здоровых доноров при профилактических исследованиях выявляются в анализах высокие титры иммуноглобулинов типа Ig A, Ig G с повышенными k,l цепями (таблица 2). Также доноры находятся под наблюдением врача-терапевта, нефролога и нуждаются в ежегодном обследовании.
Результаты изучения на носительство вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса у доноров киргизской национальности и жителей Северо-западного региона Российской Федерации представлены в таблице 3.
Таблица 3
Сравнительная оценка частоты встречаемости носительства вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса у здоровых доноров киргизской национальности и здоровых жителей Северо-западного региона Российской Федерации
|
носительство инфекции |
доноры киргизской национальности п = 78 |
жители Северо-западного региона Российской Федерации п =79 |
|
вирус Эпштейна-Барр |
26 %** |
58 % |
|
цитомегаловирус |
39 %** |
62% |
Из таблицы 3 видно, что частота встречаемости носителей вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса здоровыми донорами киргизской национальности и здоровыми жителями Северо-западного региона Российской Федерации существенно различается, среди доноров киргизской национальности вирус Эпштейна–Барр выявлен в 26 %, а цитомегаловирус – в 39 % случаев. Клинически носительство не проявлялось. Получены достоверно значимые различия (р<0,001) между донорами киргизской национальности и контрольной группой.
Следует отметить, что полученные данные являются основанием для рекомендации углубленного обследования доноров с целью правильного их подбора при планировании неродственной трансплантации костного мозга.
Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований в распределении HLA –аллелей 1 класса установлено, что наиболее часто у доноров киргизской популяции выявляются антигены в локусе А -HLA- А 11, HLA-A24, HLA- А26, локусе В- HLA- В51, HLA- В57, HLA- В37, HLA- В48,HLA-B63 и наиболее часто встречаются в распределении HLA –аллелей II класса локуса DRB1* гены HLA -DRB1*14, HLA- DRB1*09, несколько реже ген HLA-DRB1*10 и практически в единичных случаях ген HLA- DRB1*03.
Выявленные различия антигенов в распределении HLA-аллелей, повышенные титры иммуноглобулинов k,l легкими цепями, наличие носительства возбудителей вирусной инфекции, необходимо учитывать при планировании близкородственной, неродственной трансплантации костного мозга при злокачественных заболеваниях.
Потенциальным донорам костного мозга дополнительно в перечень критериев отбора необходимо определение на наличие носительства вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и содержание свободных цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови, с целью профилактики осложнений в пострансплантационном периоде.
На современном этапе для успешного поиска донора костного мозга необходимо расширять и развивать базы данных о потенциальных донорах гемопоэтических стволовых клеток.
Однако тесное сотрудничество с регистрами костного мозга других стран – это наиболее эффективное направление превращение трансплантации костного мозга в лечебный метод.
Рецензенты:
Ценёва Г.Я., д.м.н., профессор ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г.Санкт-Петербург.
Краева Л.А., д.м.н., ведущий научный сотрудник ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург.
Библиографическая ссылка
Баратова Д.А., Нурлыханов Е.Б., Баратова М.А., Баратова Д.А., Нурлыханов Е.Б. ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ НОСИТЕЛЬСТВА ВИРУСА ЭПШТЕЙНА - БАРР, ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА У ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=14285 (дата обращения: 17.09.2024).