Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Пепеляева Е.А. 1 Анисимова И.Н. 2 Гаврилова В.А. 2 Рожкова В.Т. 3 Новоселова Л.В. 1

---

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

2 ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова»

3 ГНУ «Кубанская опытная станция ВИР им. Н.И. Вавилова»

Проведен анализ 34 образцов крупноплодного подсолнечника коллекции ВИР на наличие в них маркера гена Rf1 для создания родительских форм гибрида кондитерского направления. В результате исследования подтверждено наличие SCAR-маркера Y10 среди сортов крупноплодного подсолнечника. Исследованные образцы были условно распределены в 4 группы: 1 группа – с содержанием маркера гена Rf1 у более 50% исследованных растений; 2 группа – наличие маркера у 20-50% растений, 3 группа – наличие маркера у 10-20% растений и 4 группа, у растений которой маркер не был обнаружен. Во вторую группу образцов отнесены такие сорта, как СПК, Лакомка, Бородинский, Донской крупноплодный. В первую группу отнесены 9 образцов, причем у трех образцов количество растений с наличием маркера составляет более 90%.

Статья в формате PDF

135 KB

подсолнечник

селекция

крупноплодность

восстановление фертильности

молекулярный маркер

1. Анисимова И.Н., Алпатьева Н.В., Тимофеева Г.И. Скрининг генетических ресурсов растений с использованием ДНК-маркеров: основные принципы, выделение ДНК, постановка ПЦР, электрофорез в агарозном геле // Методические указания ВИР / под ред. Е.У. Радченко. - СПб. : ВИР, 2010. - 30 с.

2. Гаврилова В.А., Анисимова И.Н. Генетика культурных растений: подсолнечник. – СПб., 2003. – 197 с.

3. Малков И.А., Гаврилова В.А., Рожкова В.Т., Анисимова И.Н. Генетическое разнообразие линий-восстановителей фертильности пыльцы подсолнечника (Helianthus annuus, Asteraceae) // Карпология и репродуктивная биология высших растений : материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной памяти профессора А.П. Меликяна (18-19 октября 2011 г., Москва). - М. : ООО «Астра-Полиграфия»», 2011. – С. 300-305.

4. Маркин Н.В. SCAR-маркер гена Rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертиль-ности пыльцы растений с различными типами ЦМС / Н.В. Маркин, М.А. Тихонова, И.Н. Анисимова, В.Т. Рожкова, В.А. Гаврилова, А.В. Усатов // Масличные культуры. – 2009. – Вып. 2 (141). – С. 3-5.

5. Horn R., Kusterer B., Lazarescu E., Prufe M., Friedt W. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1-based F1 hybrids in sunflower (helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. 2003. – Vol. 106. – P. 599-606.

6. Kusterer B. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene / B. Kusterer, R. Horn, W. Friedt // Euphytica. – 2005. – Vol. 143. – P. 35-43.

7. Eckardt N.A. Cytoplasmic male sterility and fertility restoration // The Plant Cell. – 2006. – Vol. 18. – P. 515-517.

Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) широко распространена среди высших растений. Это явление заключается в неспособности растения продуцировать жизнеспособную пыльцу, тогда как женская генеративная сфера остается в норме. Различные системы ЦМС - Rf имеют принципиальное значение при производстве гибридных семян различных культур (подсолнечника, риса, сахарной свеклы, рапса и других), так как они обеспечивают проведение контролируемого опыления материнских стерильных линий пыльцой отцовских форм без трудоемкой ручной кастрации [7].

Мужская фертильность может быть восстановлена ядерными генами восстановления фертильности пыльцы Rf-генами (Restoration of fertility). К настоящему времени у подсолнечника (Helianthus annuus) описаны более 70 источников ЦМС, каждый из которых требует присутствия в геноме определенных генов восстановления фертильности. Однако все современные промышленные гибриды подсолнечника созданы на основе одного источника ЦМС РЕТ1, полученного Леклерком из межвидового гибрида H. petiolaris × H. аnnuus.  Митохондральная ДНК форм с цитоплазматической мужской стерильностью (мтДНК РЕТ1) отличается от мтДНК фертильных форм наличием инверсии 11 т.н. и инсерции 5 т.н., приводящих к появлению новой открытой рамки считывания orfH522, ко-транскрибируемой вместе с геном atpA и кодирующей белок 16 кДа. Мужской фертильный фенотип может быть восстановлен путем введения в генотип гибрида доминантного ядерного гена Rf, который вызывает снижение уровня ко-транскрипта atpA-orfH522 в пыльниках в течение мейоза и дальнейшее снижение количества белка ORFH522. По различным данным, для восстановления фертильности пыльцы форм подсолнечника с ЦМС PET1 необходимо от одного до четырех генов. Показано, что один из генов, необходимых для восстановления фертильности форм с ЦМС РЕТ1, присутствует в генотипе большинства линий ЦМС и линий-закрепителей стерильности, а другой - Rf1 - должен быть введен из линии-восстановителя [5; 6].

О наличии генов Rf в генотипе можно судить по присутствию молекулярных маркеров, тесно сцепленных с ними. Было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [5], может использоваться для поиска носителей гена Rf1 [4].

Производство  гибридных семян, проявляющих эффект гетерозиса в первом поколении, - основная методика повышения урожайности, валового сбора семян с высокими технологическими качествами. Для их промышленного производства используют материнские линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) [2].

Большинство созданных на основе системы ЦМС-Rf  гибридов подсолнечника имеют масличное направление, тогда как кондитерскому направлению уделялось недостаточное внимание. В настоящее время существует необходимость в создании гибридов кондитерского направления отечественной селекции, так как возрастает спрос на производство кондитерского сырья.

В коллекции генетических ресурсов подсолнечника ВИР, насчитывающей  2230 образцов культурного и 630 образцов дикорастущих видов, имеется 85 линий-восстановителей фертильности пыльцы масличного направления, однако они не могут быть использованы  при создании крупноплодного гибрида, так как не соответствуют необходимым критериям (недостаточный размер семянки, высокая масличность) [2].

На данный момент крупноплодные отцовские линии-восстановители пыльцы в коллекции отсутствуют. Цель данного исследования заключалась в исследовании сортов крупноплодного подсолнечника для поиска в них генов Rf1 при помощи SCAR-маркеров с дальнейшим созданием из них отцовских линий.

Материал и методы

Материалом  исследования служили 34 образца крупноплодного подсолнечника из коллекции ВИР, включающие 30 сортов отечественной и зарубежной селекции, одну линию (ВИР479), сорт Хейлудзянский, который был разделен на 3 фенотипически различные группы, и сорт Местный-9, который также был разделен на 2 формы - ветвистую и неветвистую. Весь материал репродуцирован в условиях Кубанской опытной станции ВИР. Геномную ДНК выделяли из этиолированных проростков с использованием модифицированного СТАБ-метода [1; 3]. В экстракционный буфер вводили поливинилпирролидон (PVP) 40000 и метабисульфит натрия; для удаления РНК полученные фракции ДНК инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в присутствии РНКазы А. Для амплификации маркерного фрагмента HRG02 использовали праймер Y10 (прямой 5΄-AAA CGT GGG AGA GAG GTG G-3΄, обратный 5΄-AAA CGT GGG  CTG AAG AAC TA-3΄). ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 94 °С (45 сек), отжиг праймеров при 65 °С в течение 45 сек, элонгация при 72 °С (60 сек), количество циклов 35. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 50 нг геномной ДНК, однократный реакционный буфер 10x (1,5 мM MgCl2), по 0,4 мкМ каждого из праймеров, по 0,2 мМ каждого dNTP и 0,2 ед. Taq-полимеразы. Электрофорез проводился в 1,8%-ном агарозном геле. В опытах проанализировали в среднем по 8 растений из каждого образца.

Результаты и обсуждение

На ДНК изученных генотипов праймеры Y10 инициировали синтез фрагмента HRG02 ожидаемого размера (740 п.н.) либо не давали продуктов амплификации. В основном сорта подсолнечника демонстрировали гетерогенность по наличию-отсутствию маркерных последовательностей HRG02, что можно объяснить неоднородностью геномов сортов по сравнению с инцухт-линиями, которые представляют собой не одно поколение инбридинга.

В результате исследованные образцы крупноплодного подсолнечника были условно размещены в 4 группы в зависимости от количества растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10 (таблица 1). Первая группа включает образцы с наличием маркера Y10 у более половины исследованных растений, вторая группа - наличие маркера у 20-50% растений, третья - у 10-20%, у четвертой группы маркер Y10 отсутствовал.

Таблица 1. Результаты скрининга образцов коллекции с использованием SCAR-маркера локуса Rf1

Примечание: * - количество растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10, выраженное в процентном соотношении от общего числа проанализированных растений данного сорта.

Из полученных данных можно сделать вывод о наличии у большинства исследованных сортов в геноме гена Rf1, так как лишь у 8 из 34 образцов маркер Y10 отсутствовал полностью. У 9 сортов: и-610064, Хейлудзянский-1, Китай; к-2676, Украина; и-610067, с. 03002, Китай; к-2801, Приморский край; б/к, Северная Дакота, США; к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый); к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый); к-3578, с. Местный-2, Украина; к-2664, Приморский край наличие маркера Y10 выявлено более чем у 60% проанализированных растений каждого образца. Причем необходимо отметить, что среди выявленных образцов присутствуют сорта как отечественной, так и зарубежной селекции.

Среди изученных образцов, в настоящий момент районированы кондитерские сорта подсолнечника - СПК, Лакомка, Донской крупноплодный, Бородинский. В сортах СПК, Донской крупноплодный и Бородинский в геноме половины исследованных растений каждого образца обнаружен маркер гена Rf1, в сорте Лакомка маркер Y10 присутствовал у 4 из 12 растений, это особенно важно, так как эти образцы имеют особенно ценные качества. Из данных сортов возможно создание отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы и в будущем гибрида кондитерского направления.

Для подтверждения достоверности данных молекулярно-генетического анализа необходимо провести гибридологический анализ в полевых условиях, причем образцы, показавшие полное отсутствие маркера Y10, в анализ не будут включены, что значительно сократит объем проводимых исследований. Также необходимо увеличить количество индивидуальных скрещиваний у сортов с незначительным процентным содержанием маркера гена Rf1 для повышения вероятности обнаружения растения, несущего интересуемый ген.

Таким образом, имеется потенциальная возможность создать отцовские линии-восстановители фертильности пыльцы кондитерского направления из образцов крупноплодного подсолнечника генетической коллекции ВИР им. Вавилова.

Работа частично поддержана РФФИ (проект № 12-04-00329).

Рецензенты:

Демурин Я.Н., д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетики ГНУ «ВНИИМК Россельхозакадемии», г. Краснодар.

Колясникова Н.Л., д.б.н., доцент, зав. кафедрой ботаники и генетики, физиологии растений и биотехнологий, ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», г. Пермь.

Библиографическая ссылка