Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИССЛЕДОВАНИЕ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА В ЛИМФОЦИТАХ БОЛЬНЫХ ГРИППОМ

Сергеева И.В. 1 Лычковская Е.В. 1 Тихонова Е. П. 1 Камзалакова Н.И. 1 Булыгин Г. В. 1
1 ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России»
Грипп человека – острое высококонтагиозное инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое вирусами гриппа. В общей структуре инфекционных болезней на долю гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций приходится до 92%. Патогенез гриппа является результатом взаимодействия множества факторов макроорганизма с вирусными белками. Рецепторы клеток, к которым вирусы гриппа человека имеют предпочтение, экспрессируются на эпителиальных клетках на всем протяжении дыхательных путей – в слизистой оболочке носа, околоносовых пазухах, глотке, трахее, бронхах, бронхиолах и альвеолах, но их количество различно на разных участках. В период пандемии основным фактором риска развития гриппозной вирусной пневмонии является отсутствие специфической защиты легких антителами против родственных штаммов вируса. Важную роль в патогенезе гриппа играет иммунная система. Установлено, что вирусы гриппа в процессе своей эволюции приобрели механизмы, которые способны ограничивать и подавлять иммунитет хозяина. Проявление в полном объеме функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток в процессе распознавания антигена и формирования иммунного ответа происходит лишь при соответствующем состоянии их внутриклеточного метаболизма, который обеспечивается определенным уровнем активности внутриклеточных ферментов.
апоптоз
лимфоцит
грипп
1. Андерсон Р. Инфекционные болезни человека. Динамика и контроль / пер. с англ. - М. : Научный Мир, 2004. - 784 с.
2. Белова Е.Г. Грипп - болезнь всех возрастов // Лечащий врач. - 2003. - № 10. - С. 73-75.
3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. - М. : Медицинское информационное агентство, 2005. - 736 с.
4. Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика / под редакцией акад. РАМН проф. О.И. Киселева, д-ра мед. наук Л.М. Цыбаловой, акад. РАМН проф. В.И. Покровского. - М. : Медицинское информационное агентство, 2012. - 496 с.
5. Ильичева Т.Н. Репродукция вируса гриппа человека и иммунопатогенез вызываемого им заболевания / Т.Н. Ильичева, С.И. Бажан, А.М. Шестопалов, С.В. Нетесов // Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10, № 4. - С. 59-65.

Введение

Грипп человека - острое высококонтагиозное инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое вирусами гриппа. В общей структуре инфекционных болезней на долю гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций приходится до 92% [1; 2]. Патогенез гриппа является результатом взаимодействия множества факторов макроорганизма с вирусными белками. Рецепторы клеток, к которым вирусы гриппа человека имеют предпочтение, экспрессируются на эпителиальных клетках на всем протяжении дыхательных путей - в слизистой оболочке носа, околоносовых пазухах, глотке, трахее, бронхах, бронхиолах и альвеолах, но их количество различно на разных участках. В период пандемии основным фактором риска развития гриппозной вирусной пневмонии является отсутствие специфической защиты легких антителами против родственных штаммов вируса [4].

Важную роль в патогенезе гриппа играет иммунная система. Установлено, что вирусы гриппа в процессе своей эволюции приобрели механизмы, которые способны ограничивать и подавлять иммунитет хозяина. Проявление в полном объеме функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток в процессе распознавания антигена и формирования иммунного ответа происходит лишь при соответствующем состоянии их внутриклеточного метаболизма, который обеспечивается определенным уровнем активности внутриклеточных ферментов [3; 5].

Цель работы. Установить уровень апоптоза в лимфоцитах больных тяжелой формой гриппа.

Материал и методы исследования. Проведено исследование апоптоза и некроза лимфоцитов у 21 больного с тяжелой формой гриппа методом детекции апоптоза с помощью системы AnnexinV-FITC на клеточных мазках (после выделения культуры клеток из цельной периферической крови). Для сравнения обследованы 8 больных с присоединением бактериальных осложнений на фоне гриппа и проведением антибактериальной терапии в течение 3-5 дней.

Диагноз гриппа был подтвержден методом ИФА, РТГА, а генетический материал вирусов определяли в крови методом ПЦР. За диагностически достоверное принимали увеличение оптической плотности на 0,5 ед. и более в ИФА в динамике заболевания и 4-кратное нарастание титров антител в РТГА (диагностикумы вирусов гриппа А/H0N1/, А/H1N1/, А/H2N2/, А/H3N2/, В).

Всем обследованным пациентам проводилась оценка параметров периферической крови, показателей иммунитета. Иммунологические исследования включали в себя определение в крови методом проточной цитофлуориметрии: Т-лимфоцитов, несущих CD3+, и регуляторных субпопуляций лимфоцитов CD4+ и CD8+ (с подсчетом соотношения CD4/CD8), а также CD19-лимфоцитов. Также иммуноферментным методом определялись в сыворотке крови концентрация сывороточных IgA, IgM и IgG и ЦИК, а кроме того, - количественные показатели фагоцитарного звена.

У всех больных в лимфоцитах, выделенных из венозной крови на градиенте плотности фиколл-верографина, биолюминесцентным методом с использованием бактериальной люциферазы, проводилось определение активности внутриклеточных ферментов. Определялись следующие энзиматические показатели: активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ и НАДФГДГ), НАД- и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназ (НАДМДГ и НАДФМДГ), а также глутатионредуктазы (ГР). Активность ферментов выражалась в мкЕ на 10000 лимфоцитов.

Кроме больных гриппом, были обследованы 37 практически здоровых лиц

Статистический анализ результатов исследования проводился методом Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение. Оценка энзиматических параметров лимфоцитов у больных с тяжелым течением гриппа и тяжелым осложненным гриппом - позволила установить следующие особенности внутриклеточного метаболизма лимфоцитов обследованных.

При тяжелой степени гриппа одним из важнейших обстоятельств, влияющих на функциональное состояние этих клеток, является резкое - в 3,34 раза снижение активности Г6ФДГ, по сравнению с контрольным уровнем. Активность Г3ФДГ, ЛДГ, НАДФГДГ превышала значения группы контроля. Для НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ в лимфоцитах больных тяжелой степенью гриппа отмечено еще более выраженное, по сравнению с контролем ингибирование. Снижение активности Г6ФДГ обращает на себя внимание в связи с тем, что этот показатель отражает снабжение субстратами ПФП, который во многом играет определяющую роль в обеспечении полноценного участия лимфоцитов в иммунном ответе. Резкое уменьшение субстратного потока на ПФП отражает снижение способности этих клеток к синтезу иммуноглобулинов, цитокинов и их пролиферативных возможностей. В совокупности перечисленные факторы могут ограничивать развитие адекватного иммунного ответа и определять более тяжелое течение заболевания.

Тяжелая осложненная форма гриппа сопровождается выраженной интенсификацией ряда внутриклеточных реакций ЦТК, о чем свидетельствуют высокие показатели активности всех ферментов, функционирующих в этом цикле или в ассоциированных с ним реакциях (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ, НАДГДГ и НАДФГДГ, НАДМДГ и НАДФМДГ), а также ГР. По-видимому, высокий уровень выработки АТФ в ЦТК может являться провоцирующим фактором активации апоптоза - энергозависимого процесса, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма (лимфоциты, пораженные вирусом гриппа).

Следует отметить и тот факт, что в лимфоцитах больных с тяжелым осложненным течением гриппа максимально высоки показатели активности ЛДГ и Г3ФДГ, свидетельствующие о включении «аварийного» механизма - активации гликолиза, происходящего при чрезмерном функциональном напряжении клеток. Обращает на себя внимание показатель активности Г6ФДГ, который по своей величине не отличается от контрольного значения. Отсутствие метаболической реакции в виде увеличения потока субстратов на ПФП может быть одним из существенных обстоятельств, определяющих в совокупности с изложенными выше факторами условия как для развития более тяжелого варианта течения гриппа, так и для присоединения бактериальных осложнений основного заболевания.

Результаты исследования активности ферментов в лимфоцитах больных гриппом позволили сделать заключение о том, что снижение функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток и иммунной системы в целом зависит от особенностей внутриклеточных метаболических процессов.

Иммунологические параметры больных с тяжелой формой гриппа отражают ингибирование специфического иммунного ответа. Для них характерно наличие относительной и абсолютной лимфопении и Т-иммунодефицита (как проявление сниженных способностей лимфоцитов к пролиферации), снижение количества CD4-клеток при увеличении CD8-лимфоцитов, дисиммуноглобулинемии (в результате уменьшения способности лимфоцитов к синтезу иммуноглобулинов), достоверного угнетения поглотительной способности фагоцитов. Значительная часть изменений показателей иммунного статуса этих больных также, вероятно, во многом обусловлены низким уровнем активности Г6ФДГ. В то же время ферментные показатели лимфоцитов этих больных позволяют предполагать существование в них уровня энергопродукции, способного обеспечить функциональные возможности клеток, достаточные для предупреждения развития у больных этой группы осложнений основного заболевания.

Подобные, но еще более выраженные изменения иммунной защиты по параметрам клеточного звена, отмечены у больных с тяжелой осложненной формой гриппа: выраженная относительная и абсолютная лимфопения, а также Т-иммунодефицит (несмотря на имеющийся лейкоцитоз). Кроме того, у этих пациентов отсутствовала активация гуморального звена, необходимая для адекватного иммунного ответа при острой вирусной инфекции. Вероятно, в значительной степени защита от инфекции у больных этой группы осуществлялась за счет повышенной активности фагоцитирующих клеток, функциональная активность которых была высокой. Вирусы гриппа А способны индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. В пользу этого могут свидетельствовать высокие (а в большинстве своем - максимальные среди всех групп) уровни активности энергопродуцирующих реакций не только ЦТК, но и гликолиза, считающегося «аварийным» механизмом дополнительной выработки АТФ, который включается при чрезмерном функциональном напряжении клеток. Известно, что высокий уровень выработки АТФ может являться провоцирующим фактором активации апоптоза - энергозависимого процесса, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма (например, лимфоциты, пораженные вирусом гриппа). Отсутствие же вполне объяснимой и необходимой в условиях вирусной инфекции активации гуморального звена иммунной системы можно связать с тем, что в лимфоцитах больных этой группы уровень активности Г6ФДГ (а значит и снабжение субстратами ПФП) не отличался от того, который определялся в контроле. Отсутствие реакции метаболизма в виде увеличения потока субстратов на ПФП может быть одним из существенных обстоятельств, определяющих в совокупности с изложенными выше факторами условия как для развития тяжелой формы гриппа, так и для присоединения бактериальных осложнений основного заболевания.

Вирус гриппа, как уже было указано, являясь индуктором апоптоза лимфоцитов, может быть причиной перевода физиологического апоптоза этих клеток в патологический, приводящий к дисфункции клеточного звена иммунитета.

Для подтверждения полученных метаболических нарушений было проведено исследование апоптоза и некроза лимфоцитов у 21 больного с тяжелой формой гриппа. Для сравнения обследованы 8 больных с присоединением бактериальных осложнений на фоне гриппа и проведением антибактериальной терапии в течение 3-5 дней проведения. Полученные данные представлены в таблице 1.

Статистический анализ результатов исследования методом Манна-Уитни показал высокий уровень апоптоза в лимфоцитах больных тяжелой формой гриппа (P < 0,001) по сравнению с некрозом. В группе пациентов с бактериальными осложнениями и антибактериальной терапией различий не выявлено (P < 0,06).

Таблица 1 - Уровень апоптоза и некроза в лимфоцитах обследованных больных гриппом

Больные с тяжелой формой гриппа (n=21)

Больные гриппом, осложненным бактериальной инфекцией и проводимой антибактериальной терапией (n=8)

1

2

3

4

Уровень апоптоза

Уровень некроза

Уровень апоптоза

Уровень некроза

26,4%

58,8%

4,0%

94,0%

60,0%

40,0%

15,8%

84,0%

57,6%

32,0%

31,0%

60,0%

50,3%

29,0%

14,5%

79,0%

44,6%

52,0%

0,0%

97,0%

71,0%

25,5%

0,0%

70,0%

80,8%

18,7%

0,0%

75,0%

73,0%

23,0%

0,0%

97,0%

75,0%

17,6%

 

 

69,8%

28,0%

 

 

71,4%

25,4%

 

 

Средние %

 

 

 

61,81%

31,82% (p1<0,001)

8,16%

82,00% (p3<0,06)

Примечание: Р1, Р3 - достоверность различий по U-критерию Манна-Уитни с показателем соответствующего столбца

Заключение. Таким образом, результаты подтверждают полученные данные по метаболическим нарушениям в лимфоцитах больных при тяжелых формах гриппа. Клинический вариант тяжелых форм гриппа формируется при снижении пролиферации и дифференцировки лимфоцитов за счет высокого уровня апоптоза, что имеет важную роль в патогенезе заболевания.

Рецензенты:

Новицкий И.А., д.м.н., профессор, в.н.с. клинического отделения соматической патологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Красноярск.

Мартынова Г.П., д.м.н., профессор, зав. кафедрой детских инфекционных болезней с курсом ПО Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск.


Библиографическая ссылка

Сергеева И.В., Лычковская Е.В., Тихонова Е. П., Камзалакова Н.И., Булыгин Г. В. ИССЛЕДОВАНИЕ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА В ЛИМФОЦИТАХ БОЛЬНЫХ ГРИППОМ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=11057 (дата обращения: 28.11.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074