Введение

Появление значительного количества штаммов бактерий, резистентных к антибиотикам широкого спектра действия, определяет необходимость синтеза новых антибактериальных препаратов и изучения механизмов их действия. Органические соединения селена являются одними из перспективных в этом отношении. Установлена высокая антибактериальная активность ряда селеноорганических соединений против широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также различных грибов и вирусов (4Н-селенопиранов и солей селенопирилия, селеноксантенов, селеноциклогексанов, бензоселенохроменов, бензисоселеназолов, селенадиазолов и др.) [8-12].

В настоящее время в ряде регионов России в животноводстве и птицеводстве применяется селеноорганический препарат диацетофенонилселенид (ДАФС-25) [2], проводится синтез и изучение биологической активности его производных.

Следует отметить, что в настоящее время в медицинской практике применяются хлорсодержащие (хлоргексидин, триклозан) и фторсодержащие (фторхинолоны) препараты, оказывающие выраженное антимикробное действие [1, 5].

В связи с этим целью нашей работы явилось изучение сравнительной антимикробной активности селеноорганического соединения диацетофенонилселенид и его галогенопроизводных в отношении клинических штаммов кишечной палочки Escherichia coli (E. coli).

Материалы и методы

В эксперименте использовали препараты 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 - диацетофенонилселенид (соединение 1) и его галогенопроизводные: 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 2) и 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 3) в различных концентрациях (рис. 1).

Соединение 1

Соединение 2

Соединение 3

Рис. 1. Структурная формула исследуемых препаратов – 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 - диацетофенонилселенид (соединение 1), 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 2) и 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 3)

Эксперимент проводили на клинических штаммах E. coli. Штаммы бактерий выделяли от больных с гнойными осложнениями, находящихся на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО). Видовую идентификацию штаммов проводили на основании изучения фенотипических свойств. Бактерии обладали резистентностью к пяти и более профильным антибиотикам: бета-лактамам (цефалоспорины 1–2 поколения, оксациллин, метициллин), макролидам (эритромицин), фторхинолонам (ципрофлоксацин, левофлоксацин), аминогликозидам (гентамицин) и ванкомицину.

Суспензию бактерий готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича, путём последовательных разведений до конечной концентрации бактерий – 3·105 клеток в 1 мл.

1 мг соединения растворяли в 100 мкл ДМФА (диметилформамида), добавляли 900 мкл 0.9 %-ного NaCl - проба 1 (1 мг/мл). В качестве контроля использовали 1 мл ДМФА +9 мл 0.9 %-ного NaCl. Затем из пробы 1 отбирали 100 мкл, добавляли 900 мкл из контрольной пробирки, получая пробу 2 (0.1 мг/мл). Из пробы 2 отбирали 100 мкл содержимого, добавляли 900 мкл из контроля, получая пробу 3 (0.01 мг/мл). Из пробы 3 отбирали 100 мкл раствора, добавляли 900 мкл из контроля, получая пробу 4 (0.001 мг/мл).

В пробирки с разведениями препарата добавляли по 100 мкл конечной суспензии (3·105 КОЕ/мл) микроорганизмов, встряхивали и инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 150 мин при комнатной температуре.

В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведенные в аналогичных пропорциях с контролем (ДМФА с 0.9 %-ным NaCl), а также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси из каждой пробирки в количестве 100 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 часа при 37 ºС. Подсчет колоний производили на следующий день.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 6.0. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро –Уилкса). Большинство данных не соответствуют закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U-критерий Манна – Уитни, на основании которого рассчитывался Z – критерий Фишера и показатель достоверности p. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0.05.

Результаты и их обсуждение

Антимикробная активность исследованных препаратов зависела от наличия в молекуле бокового радикала. Так, соединение 1 (ДАФС), лишенное боковых заместителей у фенильных колец, проявляло антибактериальную активность на клинические штаммы E. coli только в максимальной концентрации 1 мг/мл (табл. 1).

Причем антибактериальный эффект возрастал по мере увеличения времени инкубации. При инкубации 60 минут соединение 1 подавляло рост колоний кишечной палочки на 30.7 % (р<0.05), при инкубации 90 минут – на 43.4 % (р<0.05), при инкубации 120 минут – на 85.3 % (р<0.05) и при инкубации 150 минут – на 87.9 % (р<0.001) соответственно по сравнению с контролем. При максимальной инкубации препарат ДАФС был также эффективен в концентрации 0.1 мг/мл и вызывал достоверное уменьшение роста колоний кишечной палочки на 61.6 % (р<0.001) по сравнению с контролем. Достоверная антибактериальная активность также наблюдалась при минимальной инкубации 30 минут в концентрации соединения 1 0.001 мг/мл (табл. 1).

Следовательно, клинические штаммы E. coli чувствительны только к высокой концентрации препарата ДАФС. Причем эта чувствительность возрастает по мере увеличения времени инкубации и составляет максимум при инкубации 120 и 150 минут в концентрации 1 мг/мл.

Соединение 2 оказывало антибактериальное действие на клинические штаммы E. coli в концентрациях от 1 до 0.001 мг/мл и при инкубации 30–150 минут (табл. 2). Минимальная концентрация этого соединения (0.001 мг/мл) эффективно подавляла рост клеток кишечной палочки при инкубации в течение 60–150 минут на 33.5 % (60 минут), 31.2 % (90 минут), 41.0 % (120 минут), 47.2 % (150 минут) (р<0.05).

В концентрации 0.01 мг/мл соединение 2 достоверно уменьшало число клеточных колоний E. coli на 37.1 % (30 минут), 49.6 % (60 минут), 51.1 % (90 минут), 75.6 % (120 минут), 75.9 % (150 минут) соответственно по сравнению с контролем (р<0.05).

Антибактериальная активность препарата 2 в концентрации 0.1 мг/мл выражалась в подавлении роста бактериальных клеток кишечной палочки на 74.9 % (30 минут), 69.6 % (60 минут), 90.0 % (90 минут) соответственно (р<0.05). При инкубации клеток кишечной палочки с соединением 2 в концентрации 0.1 мг/мл в течение 120 и 150 минут рост колоний подавлялся полностью (р<0.001) (табл. 2).

Таблица 1. Антибактериальное действие соединения 1 на клинические штаммы E.coli

Примечания: в каждом случае приведены средняя величина (медиана – Ме), нижний и верхний квартили (25 %;75 %).

Zк, pк – различия по сравнению с группой контроля.

Таблица 2. Антибактериальное действие соединения 2 на клинические штаммы E.coli

Примечания: в каждом случае приведены средняя величина (медиана – Ме), нижний и верхний квартили (25 %;75 %).

Zк, pк – различия по сравнению с группой контроля.

Наконец, в максимальной концентрации соединения 2 (1 мг/мл) наблюдалась наибольшая антимикробная активность в отношении клеток E. coli. При этом уменьшалось число колоний на 93.9 % (30 минут), 97.3 % (60 минут). При инкубации клеток кишечной палочки с соединением 2 в концентрации 1 мг/мл в течение 90, 120 и 150 минут рост колоний подавлялся полностью (р<0.001) (табл. 2).

Полученные результаты демонстрируют высокую антибактериальную активность соединения 2 в отношении клинических штаммов E. coli. Однако полное подавление роста бактерий наблюдалось лишь в максимальной концентрации этого препарата 1 мг/мл и при длительной инкубации 120 и 150 минут. При краткосрочной инкубации (30 минут) препарат 2 был высоко эффективен только в концентрациях 1 и 0.1 мг/мл. Тем не менее, соединение 2 оказывало достоверное антибактериальное действие во всех исследованных концентрациях при времени инкубации от 60 до 150 минут.

Сравнительно большая антибактериальная активность соединения 2 (хлорсодержащего аналога препарата ДАФС) по сравнению с соединением 1 (ДАФС), вероятно, связана с наличием в структуре соединения 2 двух атомов хлора.

Полученные результаты демонстрируют высокую антибактериальную активность соединения 3 в отношении клинических штаммов E. coli. Соединение 3 эффективно подавляло рост бактериальных клеток во всех исследованных концентрациях (0.001–1 мг/мл) и при разном времени инкубации 30–150 минут (табл. 3).

Значительное уменьшение числа клеточных колоний наблюдалось при инкубации клеток кишечной палочки с соединением 3 в минимальной концентрации 0.001 мг/мл: на 41.1 % (30 минут) (р<0.001), 50.2 % (60 минут) (р<0.05), 77.6 % (90 минут), 89.7 % (120 минут), 99.2 % (150 минут) (р<0.001) соответственно.

Соединение 3 в концентрациях 0.01-1 мг/мл проявляло более выраженную антибактериальную активность, значительно уменьшая число выросших колоний. Например, это соединение в концентрации 0.01 мг/мл подавляло рост колоний E. coli на 62.9 % при инкубации 30 минут, на 99.8 % при инкубации 60 минут и на 94.6 % при 90-минутной инкубации (р<0.001). При увеличении времени инкубации до 120 и 150 минут рост бактериальных клеток прекращался (р<0.001).

Наибольший антибактериальный эффект соединения 3 наблюдался в высоких концентрациях (0.1 и 1 мг/мл). При этом при 30-минутной инкубации штаммов кишечной палочки с этим соединением в концентрации 0.1 мг/мл отмечалось уменьшение числа бактериальных колоний на 77.0 %, а при инкубации 60 минут – на 91.3 % (р<0.001) соответственно по сравнению с контролем. Увеличение времени инкубации до 90, 120 и 150 минут приводило к полному подавлению роста бактериальных клеток E. coli.

Таблица 3. Антибактериальное действие соединения 3 на клинические штаммы E.coli

Примечания: в каждом случае приведены средняя величина (медиана – Ме), нижний и верхний квартили (25 %;75 %).

Zк, pк – различия по сравнению с группой контроля.

Наконец, соединение 3 в концентрации 1 мг/мл подавляло рост колоний кишечной палочки на 79.3 % при 30-минутной инкубации и на 96.9 % при 60-минутной инкубации. При более длительной инкубации (90, 120, 150 минут) клинических штаммов E. coli рост клеток подавлялся полностью (табл. 3).

Следовательно, среди изученных селеноорганических соединений, соединение 3 оказывало наибольшее антибактериальное действие на клинические штаммы E. coli во всех исследованных концентрациях и при разном времени инкубации, достигая максимума в концентрациях 0.01–1 мг/мл и при длительной инкубации от 90 минут и более.

Заключение

В проведенном исследовании антимикробная активность селеноорганических препаратов возрастала в направлении 1 → 2 → 3. Сравнительно большая антибактериальная активность препаратов 2 и 3 в отношении клинических штаммов E. coli объясняется наличием в их структуре галогенов – фтора и хлора соответственно. Известно, что фтор – самый электроотрицательный элемент и самый мощный окислитель, поэтому благодаря наличию двух атомов фтора соединение 3 приобретало прооксидантные свойства и, как следствие, становилось самым токсичным из всех исследованных селеноорганических препаратов, проявляя максимальную антибактериальную активность.

Окислительные свойства хлора значительно слабее, чем у фтора, поэтому хлорсодержащий аналог препарата ДАФС (соединение 2) обладал меньшей антимикробной активностью по сравнению с соединением 3.

Кроме того, особенности строения мембран грамотрицательных бактерий обусловливают неэффективность большинства синтетических и натуральных антимикробных агентов против таких грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, поскольку клеточная стенка грамотрицательных бактерий для большинства химических соединений является непроницаемой, что связано с особенностями ее строения. Единственным местом проникновения служат пориновые каналы внешней мембраны, которые являются основным путем транспорта питательных веществ внутрь бактериальной клетки [6]. Количество и тип порина может изменяться с изменением условий окружающей среды, таким образом, бактериальная клетка регулирует проницаемость наружной мембраны в ответ на внешний стимул. Через пориновые каналы могут проникнуть соединения с низкой молекулярной массой и определенной пространственной структурой [3,4,7].

Исследованные в данной работе селеноорганические соединения являются низкомолекулярными гидрофобными соединениями, которые, вероятно, могут легко проникать через липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий и оказывать антимикробное действие.

Авторы выражают сердечную благодарность за помощь в подготовке статьи профессору, доктору хим. наук Древко Б. И. и канд. мед. наук Бабушкиной И. В.

Рецензенты:

Микашинович Зоя Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой общей и клинической биохимии № 1 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.

Бондаренко Тамара Ивановна, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет», г. Ростов-на-Дону.