Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF REPAIR AND CELL CYCLE CONTROL SYSTEMS` GENE POLYMORPHISMS FOR MISCARRIAGE

Kutsyn K.A. 1 Kovalenko K.A. 1 Mashkina E.V. 1 Shkurat T.P. 1
1 Southern Federal University
In this study we assessed the association of repair (APEX 1, ERCC2 (XPD)) and cell cycle control system (CHEK2) gene variants in chorion and blood samples from females with the miscarriage. The following polymorphic alleles were tested: APEX1 Asp148Glu, ERCC2 Lys751Gln, СНЕК2 1100delC. During assay of the blood samples genotype and gene variant frequency analysis did not reveal any significant difference between controls and spontaneous abortion group. During analysis of the chorionic samples significant difference in genotype and gene variant frequency for 1100delC polymorphism of СНЕК2 gene was unraveled between controls and undeveloping pregnancy group (χ2=4,15, Р=0,04). In the spontaneous abortion group decreasing of part of normal homozygotes for ERCC2 Lys751Gln and СНЕК 2 1100delC polymorphisms and increasing of part of Gln/Gln and -/- occurs in comparison with controls (χ2=6,05, Р=0,05 and χ2=7,13, Р=0,03, respectively). Also significant differences in ERCC2 Lys751Gln and 1100delC СНЕК2 gene variants frequency were revealed between control and undeveloping pregnancy groups (χ2=3,84, Р=0,05 and χ2=8,55, Р=0,003). Our results suggest that the presence of the polymorphic variants of repair system genes in the genotype lead to the spontaneous abortion susceptibility.
cell cycle control
repair system
gene variants
miscarriage
Введение

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в профилактике и лечении невынашивания беременности, частота данной патологии остается стабильной и достаточно высокой. Так, по данным литературы, она составляет от 2 до 55 %, достигая в первом триместре 80 % [1]. Различные виды самопроизвольных абортов (от неразвивающейся беременности до привычного невынашивания беременности) рассматриваются в качестве мультифакториальных заболеваний [2, 10].

На сегодняшний день в клиническую практику входит анализ потенциальных факторов риска выкидыша: отцовские хромосомные аномалии, материнские тромбофлебические, анатомические, эндокринные и иммунологические заболевания [4, 5, 12]. На данный момент исследован аллельный полиморфизм более 90 генов, относящихся к генной сети патологии беременности. В последнее время внимание сфокусировано на изучении генов, специфичных для функционирования плаценты (PAPPA, IGF-2, STAT3). Однако все накопленные на сегодняшний день данные о генетической составляющей генеза патологии беременности весьма противоречивы [10].

Аллельный полиморфизм генов системы репарации и контроля клеточного цикла подробно рассмотрен при изучении этиологии и патогенеза различных раковых заболеваний, в то же время вовлеченность полиморфизмов данных генов в развитие патологии беременности практически не исследована [9, 10, 11]. Имеются данные о связи между мутациями С-концевого мотива и участка, ответственного за его хеликазную активность XPD, и развитием плацентарной недостаточности и риском возникновения других осложнений беременности (таких как преэклампсия, синдром HELLP, повышенный уровень ХГЧ в сыворотке крови матери). Это связано с изменением связывания XPD с cdk-активирующей киназой и р44 субъединицей транскрипционного фактора (TF) IIH, что приводит к ослаблению функциональной активности последнего. CDK7 субъединица данного транскрипционного фактора фосфорилирует ядерные рецепторы, что приводит к лиганд-зависимому контролю активации генов гормонального ответа, необходимому для нормального развития плаценты. При наличии мутаций в гене XPD происходит нарушение белок-белковых взаимодействий с TFIIH и его мишенями, необходимых для функционирования плаценты [8, 10].

Целью настоящей работы являлось изучение частот полиморфных вариантов генов системы репарации ДНК, в том числе полиморфизма Asp148Glu гена APEX1 (MIM*107748), Lys751Gln гена ERCC2 (XPD) (MIM*126340) и del1100C гена СНЕК2 (MIM+604373) у женщин с физиологическим и патологическим течением ранних сроков беременности.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования полиморфизмов генов системы репарации и контроля клеточного цикла послужили образцы ДНК, полученные из лейкоцитов периферической крови беременных женщин, а также из хорионической ткани, полученной при медицинском аборте или при спонтанном аборте раннего срока. В контрольную группу были отнесены женщины с физиологически протекавшей беременностью, решившие ее прервать на сроке 6 - 12 недель (24 образца хориона и 32 образца крови). Группу сравнения составили женщины с патологическим течением беременности: неразвивающаяся беременность (18 образцов хориона и 22 образца крови) или спонтанный аборт (14 образцов хориона и 23 образца крови). У женщин, включенных в исследуемые группы, были исключены анатомические и гормональные аномалии. Все женщины подписали информированное согласие об участии в исследовании.

Выделение ДНК из лейкоцитов крови проводили термокоагуляционным методом («ДНК-экспресс-кровь», Литех). Для выделения ДНК из тканей использовали фенол-хлороформный метод. Полиморфизмы генов APEX1, ERCC2 (XPD) и СНЕК2 анализировали с использованием набора реагентов SNP-экспресс (Литех, Москва).

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3 % агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad).

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программного пакета MS Excel. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди - Вайнберга определяли по стандартным формулам. Для всех исследуемых аллелей выявлено соответствие равновесию Харди - Вайнберга. Оценку различий в распределении полиморфных вариантов генов в обследованных группах осуществляли по критерию χ2 при помощи программы BIOSTAT. Расчет OR проводили с помощью программы GraphPadInStat3.

Результаты исследования и их обсуждение

Ни в одном из исследуемых образцов ДНК, полученных из лейкоцитов периферической крови женщин, не выявлено делеции по гену CHEK2.

Анализ частот генотипов в образцах крови по полиморфизму Asp148Glu гена APEХ1 показал, что как в контрольной группе, так и в группе с невынашиванием беременности  преобладают гетерозиготные носители данного полиморфизма (табл. 1). Около трети женщин в контрольной группе и в группе со спонтанным абортом являются гомозиготами по полиморфному варианту гена апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы.

Подобный характер распределения частот генотипов и аллелей выявлен и для полиморфизма Lys751Gln гена ERCC2 (табл. 1). Статистически значимых различий в частотах генотипов и аллелей по полиморфизмам исследуемых двух генов между контрольной группой и группами женщин со спонтанным абортом или неразвивающейся  беременностью выявлено не было.

Таблица 1. Частота генотипов (%) и аллелей генов APE1 и XPD в образцах крови беременных женщин

Ген, полиморфизм

Контроль (МА)

Патология беременности

СА, абс.(%)

χ21 (Р)

НБ, абс. (%)

χ21 (Р)

APEX1 Asp148Glu

Asp/Asp

7 (21,9%)

5 (21,7%)

0,09

(0,96)

5 (22,7%)

 

0,5

(0,78)

Asp/Glu

15 (46,85%)

10 (43,5%)

12 (54,5%)

Glu/Glu

10 (31,25%)

8 (34,8%)

5 (22,7%)

Частота аллели 148Glu

0,55

0,57

 

0,5

 

χ22(Р)

 

0,04 (0,85)

 

0,23 (0,63)

 

ERCC2 (XPD) Lys751Gln

Lys/Lys

4 (12,5%)

5 (21,7%)

1,2

(0,55)

6 (27,3%)

2,08

(0,35)

Lys/Gln

21 (59,4%)

12 (52,2%)

11 (50%)

Gln/Gln

7 (28,1%)

6 (26,1%)

5 (22,7%)

Частота аллеи 751Gln

0,55

0,52

 

0,48

 

χ22(Р)

 

0,07 (0,79)

 

0,51 (0,48)

 

Примечание: МА - медицинский аборт; СА - спонтанный аборт; НБ - неразвивающаяся беременность; χ21 - сравнение частот генотипов с контролем; χ22 - сравнение частот аллелей с контролем.

Анализ частот генотипов в образцах хориона по полиморфизмам Asp148Glu и Lys751Gln генов APEX1 и ERCC2, соответственно, показал, что как в контрольной группе, так и в группе невынашивания беременности преобладают гетерозиготные носители исследуемых полиморфизмов, в то время как по полиморфизму 1100delC гена СНЕК2 преобладают гомозиготы по нормальной аллели (табл. 2).

В группе женщин с неразвивающейся беременностью в образцах хориона не выявлено гомозигот по нормальной аллели Asp148 гена АРЕХ1, в то время как доля гетерозигот и 148Glu/Glu гомозигот повышена. Однако данные различия статистически не значимы. Характер распределения частот генотипов по полиморфизму Lys751Gln гена ERCC2 в хорионической ткани при неразвивающейся беременности не отличается от такового для контрольной группы (табл. 2).

В то же время в образцах хорионической ткани, полученных после спонтанных абортов, почти в 7 раз выше частота гомозигот по полиморфизму Lys751Gln гена ERCC2 по сравнению с контролем (OR составил 9,2 при 95 % CI 0,91 - 93,0). При этом наблюдается заметное снижение доли гомозигот по нормальной аллели (табл. 2). Гомозиготы Lys/Lys751 по гену ERCC2 имеют сниженный риск развития спонтанного аборта (OR=0,04,  95 % CI: 0,002-0,7, Р=0,03).

Анализ частот встречаемости генотипов и аллелей по полиморфизму 1100delC гена СНЕК2 показал, что среди образцов хорионической ткани, полученных от женщин с патологией беременности первого триместра, выявляются гетерозиготные по делеции данного гена (табл. 2). Распределение частот аллелей по данному полиморфизму при обеих патологиях ранних сроков беременности статистически значимо отличается от контроля (табл. 2).  У гетерозигот по данной делеции повторный риск спонтанного аборта составил 13,7 (при 95 % CI 0,66 - 286,9).

Таблица 2. Частота генотипов (%) и аллелей генов APE1 и XPD в образцах хориона

Ген, полиморфизм

Контроль (МА)

Патология беременности

НБ, абс. (%)

χ21 (Р)

СА, абс. (%)

χ21 (Р)

APEX1 Asp148Glu

Asp/Asp

4 (16,7%)

0

3,64

(0,16)

1 (7,1%)

 

0,82

(0,66)

Asp/Glu

16 (66,7%)

13 (72,2%)

11 (78,6%)

Glu/Glu

4 (16,7%)

5 (27,8%)

2 (14,3%)

Частота аллели 148Glu

0,5

0,64

 

0,54

 

χ22(Р)

 

1,61 (0,2)

 

0,09 (0,76)

 

ERCC2 (XPD) Lys751Gln

Lys/Lys

7 (29,2%)

4 (22,2%)

0,28

(0,87)

1 (7,1%)

6,05

(0,05)

Lys/Gln

16 (66,7%)

13 (72,2%)

9 (64,3%)

Gln/Gln

1 (4,2%)

1 (5,6%)

4 (28,6%)

Частота аллеи 751Gln

0,38

0,42

 

0,6

 

χ22(Р)

 

0,15 (0,7)

 

3,84 (0,05)

 

CHEK2 del 1100C

С/С

24 (100%)

15 (83,3%)

4,31

(0,12)

11 (73,3%)

7,13

(0,03)

C/del

0

3 (16,7%)

3 (20%)

del/del

0

0

1 (6,7%)

Частота аллели del1100C

0

0,08

 

0,17

 

χ22(Р)

 

4,15 (0,04)

 

8,55 (0,003)

 

Примечание: МА - медицинский аборт; СА - спонтанный аборт; НБ - неразвивающаяся беременность; χ21 - сравнение частот генотипов с контролем; χ22 - сравнение частот аллелей с контролем.

Таким образом, при анализе полученных данных установлено, что наличие определенных генотипов по полиморфным локусам генов системы репарации ДНК может оказать влияние на предрасположенность к репродуктивной патологии. К тому же, согласно рассчитанным коэффициентам соотношения шансов OR, наличие полиморфных вариантов некоторых генов системы репарации увеличивает риск повторного развития рассматриваемой нами патологии.

В течение первого триместра беременности происходит активное деление как фетальных (цитотрофобласт, плазмодиотрофобласт, первичная мезодерма), так и материнских клеток (децидуальные клетки), при этом неизбежно возникновение ошибок, которые в норме исправляются системой контроля повреждений ДНК. Очевидно, что наличие полиморфных вариантов генов системы репарации и контроля клеточного цикла посредством снижения функциональной активности BER/NER-репарационных белков и специфических протеинкиназ вносит немалый вклад в развитие патологии беременности вследствие несрабатывания механизма корректировки повреждений ДНК, появления геномной нестабильности и запуска апоптоза в материнских и фетальных клетках. Показано, что при различных осложнениях беременности наблюдается повышенный уровень апоптоза в трофобласте [3]. В результате происходит недостаточная децидуализация стромы эндометрия, способствующая неполной или слабой инвазии цитотрофобласта, что подавляет нормальные гестационные изменения в маточно-плацентарных артериях и приводит к снижению кровотока в них. Следствием этого является смерть эмбриона и отслойка трофобласта.

Наличие полиморфизма Asp148Glu гена APEX1 оказывает влияние на взаимодействие с другими участниками генной сети, приводящее к более глобальным изменениям в эффективности процессов регуляции репарации, активности транскрипционных факторов, стабильности мРНК и пр. [8]. Полиморфизм Lys751Gln гена ERCC2 (XPD) связан со сниженной хеликазной активностью [6]. Полиморфизм 1100delC гена CHEK2 приводит к экспрессии укороченного киназного домена. Это в свою очередь ослабляет все выполняемые чекпоинт-киназой функции [7]. Наличие данного полиморфизма приводит к значительному снижению эффективности работы системы контроля повреждений ДНК DDR и таким образом может повлиять на развитие патологии беременности за счет нарушения процессов контроля клеточного цикла, АТМ-CHEK2 сигнального пути нарушений ДНК, апоптоза и возникновения геномной нестабильности как в материнских, так и в фетальных тканях. Все это может привести к дефектам имплантации и снижению глубины децидуальной инвазии трофобласта, что может послужить причиной неразвивающейся беременности.

Согласно рассчитанным коэффициентам соотношения шансов OR, наличие полиморфных вариантов некоторых генов системы репарации увеличивает вероятность повторного развития невынашивания беременности, вероятно, из-за сниженной способности к взаимодействию с другими участниками системы контроля повреждений ДНК, может привести к уменьшению эффективности репарационных процессов и потенциальной связи с предрасположенностью к возникновению невынашивания беременности.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект № 12-04-31408.

Рецензенты:

Амелина Светлана Сергеевна, доктор медицинских наук, заведующая отделом биомедицины НИИ биологии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону.

Усатов Александр Вячеславович, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом изменчивости генома НИИ биологии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону.