Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Аллергия – это состояние повышенной чувствительности организма к определенному веществу или веществам (аллергенам).

На сегодняшний день аллергия является проблемой общественного здравоохранения глобальных масштабов. Согласно данным экспертных оценок Европейской академии аллергии и клинической иммунологии (EAACI) в среднесрочной перспективе (15 лет) более половины населения Европы будет страдать тем или иным видом аллергии.

Каждый третий житель России подвержен аллергии, по данным Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства России (г. Москва), прямые затраты на лечение одного больного составляют от 160 до 1900 долларов США в год. На сегодняшний день Международным Союзом Иммунологических Обществ (IUIS) зарегистрировано более 150 аллергенов. В зависимости от происхождения аллергены относятся к разным типам: бытовые (моющие средства, бытовая химия, косметика и т. д.), пыльцевые (пыльца растений, домашняя пыль и т. д.) и пищевые вещества. Одной из наиболее распространенных форм аллергических заболеваний (до 80 %) является пищевая аллергия. В странах ЕС прямые затраты на лечение пищевой аллергии составляют от 1,1 до 1,5 млрд. евро в год. Примерно в ту же сумму оцениваются непрямые затраты, обусловленные увеличением числа дней нетрудоспособности и снижением производительности труда. Таким образом, пищевая аллергия является серьезной медико-социальной проблемой [6].

В настоящее время известно более 170 различных видов продуктов питания, для которых зарегистрированы проявления пищевой аллергии. Основной причиной аллергии является нарушение функционирования иммунной системы, связанное с непереносимостью отдельных компонентов пищи, в частности, молочных белков, содержащихся в коровьем молоке и продуктах его переработки. В целях снижения антигенных свойств молочное сырье можно подвергнуть тепловой обработке. Однако термоденатурация способна приводить как к разрушению областей антигенных детерминант, так и агрегации белковых молекул, экспонированию ранее скрытых антигенных детерминант [10].

Наиболее перспективным подходом для снижения аллергенности молочных продуктов является биокаталитическая конверсия молочных белков, направленная на получение их гидролизатов с заданными молекулярно-массовым распределением и остаточной антигенностью. Особенностью действия протеолитических ферментов является их специфичность по отношению к типу пептидной связи, что позволяет получать гидролизаты с различной степенью гидролиза белка [1, 7].

Цель исследования

В данном исследовании целью является подбор оптимальных параметров ферментативного гидролиза казеина энзиматической системой, состоящей из термолизина, карбоксипептидазы А и лейцинаминопептидазы.

Материалы и методы исследования

В качестве исходного сырья использовали казеин, который является доступным и ценным в биологическом отношении источником белка, а также наиболее адаптирован к физиологическим особенностям детского организма по сравнению с другими белками [5].

Метод исследования – белковый электрофорез по Лэммли. Для анализа гидролизатов использовали денатурирующий ПААГ (12 % – разделяющий и 4 % фокусирующий) с 0,1 % DS-Na. Форез проводили на однократном электродном буфере с добавлением 0,1 % DS-Na при 15 мА. Гель окрашивали 0,2 % Кумасси R250, приготовленного на ледяной уксусной кислоте, при повышенной температуре в течение 7–10 мин, затем трижды отмывали дистиллированной водой.

Результаты и их обсуждение

Известно, что казеины, в отличие от некоторых глобулярных белков, хорошо расщепляются протеиназами в нативном состоянии, поскольку уже в нативном состоянии имеют мало упорядоченную конформацию, подобную дезорганизованной структуре денатурированных глобулярных белков [3, 4, 9]. Это объясняется очень низким содержанием α-спиралей и низкой структурной организацией основных компонентов казеина, что обусловлено высоким содержанием пролина в этих белках – от 8,5 до 16 %, что, по-видимому, деформирует его в беспорядочный клубок [8].

В работе использовали энзиматическую систему, состоящую из эндо- и экзопептидаз. В качестве эндопептидазы использовали термолизин, расщепляющий полипептидную цепь по аминокислотным остаткам с гидрофобной боковой цепью. К таким аминокислотам относятся изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин, метионин и аланин.

В качестве экзопептидаз использовали карбоксипептидазу А и лейцинаминопептидазу, катализирующие отщепление аминокислотных остатков с карбоксильного и аминного конца молекулы белка, соответственно.

Из литературных данных известно, что оптимальными параметрами работы используемых ферментов является температура 50±1°С и рН 7,5 [2]. В связи с этим гидролиз вели при данных условиях, варьируя фермент-субстратное соотношение и продолжительность процесса.

К основным показателям целенаправленных гидролизатов казеина относятся: степень гидролиза при определенных фермент-субстратных соотношениях и продолжительность при оптимальных параметрах работы ферментов. В связи с этим определен состав девяти гидролизатов казеина. Полученные результаты исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Состав и свойства гидролизатов, полученных в результате обработки термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой

Полученные результаты свидетельствуют о том, что термолизин обладает выраженной протеолитической активностью. Данные фермент-субстратного соотношения и продолжительность гидролиза 8±0,05 ч. являются наиболее оптимальными. При уменьшении или увеличении концентрации субстрата (при фермент-субстратном соотношении 1:150 или 1:50) наблюдается снижение скорости реакции. Возможно, это связано с образованием неэффективных комплексов, в которых к активному центру фермента присоединены две или несколько молекул субстрата.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что наиболее рациональным фермент-субстратным соотношением является 1:100, при рекомендуемой литературными источниками температуре 50±1°С и рН 7,50±0,01. Величина рН реакционной смеси изменяется незначительно и находится в пределах оптимальной работы ферментов.

Для наиболее детального анализа гидролиза определено молекулярно-массовое распределение в зависимости от фермент-субстратного соотношения и продолжительности ферментации. На рис. 1 и табл. 2 представлены результаты молекулярно-массового распределения пептидов, полученных методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле гидролиза термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой при фермент-субстратных соотношениях 1:50, 1:100 и 1:150 при продолжительности гидролиза 4,00±0,05, 8,00±0,05, 24,00±0,05 ч, температуре 50±1°С и рН 7,50±0,01 (М – маркер, массовая доля белка 2,0 мг/мл в буфере 0,5М трис-HCl)

Таблица 2

Характеристика пептидов, полученных в результате гидролиза термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой

Данные, представленные на рис. 1 и табл. 2, свидетельствуют о том, что гидролизаты казеина, полученные с использованием энзиматической системы, состоящей из термолизина, карбоксипептидазы А и лейцинаминопептидазы, характеризуются высоким содержанием низкомолекулярных фракций, количество которых увеличивается в процессе реакции.

Таким образом, обобщая результаты эксперимента, нами выбраны оптимальные параметры проведения реакции гидролиза: при температуре 50±1°С, фермент-субстратном соотношении 1:100 и продолжительности процесса 8,00±0,05 ч.

Работа выполнена в рамках исполнения Государственного контракта №12.527.11.0008 от 04.06.2012 года по теме «Разработка технологии получения гипоаллергенных функциональных молочных продуктов», заключённым между Министерством образования и науки РФ и ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии по федеральной целевой программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы».

Рецензенты:

Просеков Александр Юрьевич, доктор технических наук, профессор, ректор ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово.

Попов Анатолий Михайлович, доктор технических наук, профессор, проректор по научно-инновационной работе ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово.