Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

THE ANALYSIS OF NITROGEN CONTAINING FORMATIONS WITH BASIC PROPERTIES BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

Khomov Yu.A. 1 Fomin A.N. 2
1 Perm state pharmaceutical academy
2 Jaroslavl State Medical Academy
The capillary electrophoresis (CE) is the modern and high-growth method which is widely applied especially abroad in analytical practice of medicinal nitrogen containing formations with basic properties (NCFBP) including in biological samples. The variants and directions of the usage of CE are selected and systematized in the article based on literary data. Also the estimation of the method and its scope are described first of all in analysis of pharmaceutical preparations and also of the medicinal NCFBP for determination and quantitative estimation of the native substance and its metabolites in biological fluids, for determination of nonvolatile impurities, enantiomers and for carrying out of screening. CE is recognized by authors as the more perspective for NCFBP at comparison of the results of research (with method of liquid chromatography). Numerous foreign literature and increase in number of publications of domestic authors in scientific magazines serve as urgency confirmation and importance of the method of CE in analysis of NCFBP.
nitrogen containing formations with basic properties (NCFBP)
capillary electrophoresis (CE)
variants
directions of the usage

В анализе азотсодержащих соединений основного характера (АССОХ), в том числе лекарственных средств, находит всё более широкое применение, особенно в зарубежной аналитической практике, метод капиллярного электрофореза (КЭ). Принципы, терминология и оценка метода КЭ были показаны нами ранее [7]. Наряду с известными способами детектирования в последнее время получают широкое распространение современные варианты. Описан новый и простой способ определения норфлоксацина, ципрофлоцина и офлаксацина КЭ с хемилюменисцентным детектированием. Методика нашла применение для определения офлоксацина в глазных каплях, норфлоксацина в образцах мочи человека для изучения фармакокинетики препарата [9].

Капиллярный электрофорез - масс-спектрометрия (КЭ/МС) - рекомендована для фармацевтических и биотехнологических исследований [52], использована для разработки методики определения карнитина и ацилкарнитинов (его эфиров), играющих важную роль в метаболизме жирных кислот. По уровню этих компонентов в биологических жидкостях можно судить о нарушении метаболизма при проведении мониторинга. Изолирование из плазмы и мочи проводилось ТФЭ или ЖЖХ.

Лазерный флуорометрический детектор в КЭ, используемый для анализа трамадола [10], морфина [21], был применён и для быстрого анализа фуросемида в моче человека после ТФЭ. Высокая чувствительность методики позволяет определять терапевтические дозы и предложена для контроля мочи спортсменов [14].

Всё более широко применяется электроспрей ионизация масс-спектрометрия. Так, этот способ использован для количественного определения 20 натуральных аминокислот в стандартных микстурах и в детской плазме крови без дериватизации. Предел определения 3 - 20 мМ/л [42].

Метод успешно применён для совместного анализа катехоламинов (допамин, норэпинефрин, эпинефрин) и их О-метокси метаболитов (3-метокситирамин, норметанефрин и метанефрин) в образцах мочи здоровых волонтёров. Для пробоподготовки и концентрирования использованы катионобменные сорбенты [18].

Разработаны и предложены практические рекомендации по увеличению чувствительности скрещено-лучевого термолинзового детектирования в капиллярных электромиграционных методах [2], которые включают использование водно-органических растворов фонового электролита вместо водной среды.

Диодно-матричное детектирование описано для КЭ 2 местных анестетиков (лидокаин и бупивакаин) и 2 опийных алкалоидов носкапин и папаверин в обрацах мочи [41]; десяти амфетаминов в цельной человеческой крови [65].

Неводный КЭ. Кроме водного КЭ, всё более широко развивается направление неводного или безводного КЭ. Применение этого варианта помогает решить проблему КЭ анализа для лекарственных веществ, нерастворимых или труднорастворимых в воде. Использование органических растворителей и их смесей в КЭ заслуживает большого внимания  и может широко использоваться в анализе фармацевтических препаратов, стереоизомеров, а также в биологических анализах; имеет преимущества по сравнению с водным КЭ и будущие перспективы [59, 70].

Способ неводного КЭ был применён для анализа энантиомеров салбутанола в моче, после изолирования ТФЭ [48]; катехоламинов после их дериватизации [47]; для алкалоидов: берберина и ятрептизина с использованием приёма стекинга [43] и др.

Метод неводного КЭ с УФ- и электроспрей масс-спектрометрией предложен для одновременного анализа экстази и других производных амфетамина. Наилучшие результаты были получены в смеси ацетонитрил - метанол (80:20) с добавлением 25 мМ аммония формиата, 1М раствора муравьиной кислоты, при 30 кВ и 15 °С. Метод успешно применён для анализа амфетаминов в моче после ЖЖЭ [33].

Описана и валидирована методика определения флуоксетина и его главного метаболита норфлуоксетина неводным КЭ в системе метанол - ацетонитрил, содержащей 15 мМ аммония ацетата при 25° С и 25 кВ. Внутренний стандарт - проксетин. Методика использована для клинических целей при определении уровня концентрации флуоксетина и его метаболита в моче, после ТФЭ, с последующим элюированием веществ метанолом [24].

Быстрый вариант определения 3,4-метилендиоксиметамфетамина неводным КЭ и флюоресцентным детектированием в сочетании с ГХ/МС анализом в моче, после ЖЖЭ полезен и пригоден для использования в судебно-химическом анализе [57].

Возможности неводного КЭ были использованы для разделения смеси тамоксифена, имипрамина и их главных метаболитов (4-гидрокситамоксифен и дезимипрамин) в 17 мМ аммония ацетата и 1,25 % раствора уксусной кислоты (80:20), метанол и ацетонитрил; 15 кВ. Внутренний стандарт - пароксетин. Метод использован в клинической практике для определения их уровня в моче, после изолирования и очиски ТФЭ [46].

Прямое введение без пробоподготовки. Развивается направление прямого исследования пробы КЭ без предварительной экстракции и концентрирования биологических объектов. Прямое определение диуретических лекарств в моче КЭ при флуоресцентном детектировании описано для амилорида, триамтерена, бендрофлуметиазида и буметанида [34]. Методика прямого определения разработана для анализа новых цефалоспориновых антибиотиков (цефалексин, цефсулодин, цефотаксим, цефамандол, цефуроксим, цефодизим) в моче и желчи [19]. КЭ с высокочувствительным Z капилляром предложен для анализа тиамина в биологических средах (плазма, моча, слюна). Образцы мочи разбавляли водой 1:1 и напрямую вводили в прибор. Образцы плазмы предварительно обрабатывали ацетонитрилом (1:3) для осаждения белков [45].

Приём стекинга. Чувствительность метода КЭ может быть существенно повышена за счёт концентрирования образца непосредственно в капилляре. Одним из наиболее общих подходов к увеличению концентрационной чувствительности в КЭ является приём стекинга.

Стекинг был применён для анализа амитриптилина и его метаболита нортриптилина КЭ в плазме человека. Буфер - Tris (1,4 М рН 4,5), содержащий β- циклодекстрин 1 мМ и 50 % (v/v)этиленгликоля. Методика использована для анализа реальных образцов крови пациента и для изучения фармакокинетики амитриптилина [49]. Комбинация КЭ и масс-спектрометрии в сочетании с ТФЭ использована для идентификации никотина и его метаболитов в моче. Приём стекинга позволил определить никотин и котинин по этой технике в моче курильщиков 0,55 и 11,25 нг/мл соответственно [22]. КЭ с использованием стекинга был применён для определения метформина в плазме. Внутренним стандартом служил  фенформин. Буфер - 0,1 М фосфатный рН 2,5, 20 кВ. УФ-детектирование при 195 нм. Предел определения 0,25 мкг/мл. Концентрация метформина в плазме была исследована у 8 волонтёров после приёма препарата в капсулах или таблетках [20].

КЭ с приёмом стекинга описан для совместного определения клозапина и его метаболитов клозапин N-оксида и дезметилклозапина в плазме больных шизофренией. 0,2 мл плазмы экстрагировали смесью этилацетата - н-гексана - изопропанола 8:1:1. После центрифугирования аликвоту упаривали и реконструировали водой для КЭ анализа. Буфер фосфатный рН 3,0, содержащий 50 % этиленгликоля; 25 кВ, детекция при 214 нм. После длительного применения клозапина таблеток образцы крови больных анализировали. Определяемый уровень клозапина и его метаболитов позволяет рекомендовать метод в клинической практике [31]. В развитие идеи стекинга предложен новый метод on-line концентрирования при капиллярно-электрофоретическом определении аминов и аминокислот [6].

Фармпрепараты. КЭ имеет первостепенное значение для разработки методик разделения, идентификации и количественного определения лекарственных АССОХ в фармацевтических препаратах и был применён для определения леводопы и карбидола в сложных таблетках [61]; цефалоспоринов в растворе для инъекций [51]; энантиомеров трамадола [68]; для разделения энантиомеров атропина [29]; хиральных композиций в таблетках пенициллина [67]; при определении субстанций, относящихся к героину [74]. Методика качественного и количественного определения водорастворимых витаминов в витамино-минеральных комплексах методом КЭ разработана Богачук М. Н. с соавторами [3].

КЗЭ использован для разделения 6 антидепрессантов (кломипрамин, пароксетин, флуоксенин, цитолопрам, флуоксетин, и тразадон). Оптимальные условия: раствор электролита, содержащий 50мМ фосфатного буфера при рН 2,0; 25кВ. Предел обнаружения в интервале 0,03 до 11 мг/л. Методика валидирована по основным показателям и проверена в условиях анализа фармацевтических препаратов [25]. Для анализа и определения стабильности 14 цефалоспориновых антибиотиков в воде при различных температурах (+25о, +4 о и -18 о) применяли КЭ. Установлено, что деградация большинства цефалоспоринов не выше 20 % при комнатной температуре в течение 4 часов [32].

Suntornsuk L. [69] высказывает мнение о значении КЭ для развития производства лекарств и потенциально большом будущем этого метода в связи с высокой чувствительностью и эффективностью. Демонстрируется применение КЭ в фармацевтическом анализе, включая принципы, приборы и направления использования. Предложен новый подход к классификации вариантов КЭ.

Примеси. Капиллярный электрофорез применяется при определении нелетучих примесей в лекарственных АССОХ и фармацевтических препаратах. Рекомендована методика капиллярного электрофореза для определения N-метилпирролидина в качестве примеси и продукта деградации в цефепине гидрохлориде - субстанции для инъекций. Использован УФ-фотометрический вариант определения аналита при 240 нм, кварцевый капилляр, электролит - 5 мМ имидазола рН 5,1 с 3 М раствором уксусной кислоты, 25 кВ при температуре 25 оС [76]. МС детектор использован при определении D-карнитина в качестве энантиопримеси левокарнитина в фармацевтических препаратах [60]. Для отделения кислотных и основных примесей успешно использован безводный КЭ с масс- спектрометрическим детектированием [71].

Подходы к определению качества и безопасности лекарственных средств на основе методов низкомолекулярного гепарина, а также его примесей рассмотрены Ариановой Е. А. с соавторами [1].

Биологические жидкости. Из объектов анализа КЭ на АССОХ чаще используются биологические жидкости и прежде всего моча: для определения триамтерена, метотрексата и креатинина [13]; диуретиков - индапамида, гидрохлоротиазида и буметамида без преконцентрации проб с приёмом стекинга [8, 69]; катехоламинов и метанефринов [18]; хинолон-антибиотиков [40]; психотропных лекарств [39].

Важным направлением является определение КЭ метаболитов в моче: бупивакаина и его метаболитов [17]; омепразола и его метаболита 5-гидроксиомепразола [27]; совместный анализ кокаина и его метаболитов [62, 63]; антипсихотических лекарств (клозепин, локсапин) и их метаболитов [55]; офлоксацина и его метаболитов дезметилофлоксацина и офлоксацина N-оксида после прямого введения пробы в капилляр [36].

Тандем КЭ/электроспрей ионизации масс-спектрометрии применён для изучения процессов метаболизма нейролептика галопиридола и может быть использован как инструмент аналитичекой диагностики [37].

КЭ при анализе плазмы был применён для определения: морфина без предварительной пробоподготовки [50]; сульфаметаксазола и триметоприна [64]; в сыворотке был анализирован ламивудин [30] и трициклические антидепрессанты [26].

Для определения лидокаина и его метаболитов в плазме применён неводный КЭ, УФ- и МС-детектирование [75]. Проведено определение метаболитов кокаина в пятнах крови, в следах пота и волосах [66].

Количественный биоанализ лекарственных энантиомеров проведён в плазме в тандеме КЭ и МС. Оптимизированы условия для фармакологического исследования [56]. Проведён терапевтический мониторинг антидепрессантов КЭ в биологических жидкостях с целью выяснения влияния веществ и их метаболитов на лечение депрессивных состояний [53]. Использование тандема КЭ/масс-спектрометрия и КЭ/электроспрей ионизация масс-спектрометрия позволяет определять морфин и опиоиды, их глюкурониды с целью мониторинга и токсикологического контроля мочи [78]. Образцы крови и мочи пациентов с различными метаболическими нарушениями анализировали КЭ. Наиболее высокую чувствительность показал вариант КЭ-МС-МС и рекомендован для проведения мониторинга как инструмент аналитической диагностики [54].

Энантиомеры. Hempel G., Blaschke G. [35] предложена методика стереоселективного определения зопиклона и его главных метаболитов в моче. После добавления внутреннего стандарта (золпидем) образцы мочи экстрагировали при рН 8 смесью хлороформ - изопропанол и аналиты анализировали КЭ с β-циклодекстрином в качестве хирального селектора, используя УФ-лазерно-флуоресцентное детектирование при 325 нм. Исследованы образцы мочи двух волонтёров после перорального применения 7,5 мг зопиклона. Энантиомеры зопиклона были количественно определены в слюне.

КЭ с УФ-детектированием был использован для изучения миграционного поведения и разделения трамадола, его 5 изомеров и 3 метаболитов - глюкуронидов. Разделение трамадола и всех аналитов проведено с использованием 65 мМ тетрабората при рН 10,65 в качестве электролита. Проведён скрининг реальных образцов мочи (после приёма разовой дозы 50 мг трамадола). После ТФЭ трамадол и его метаболиты были детектированы на электрофореграмме в сравнении со стандартами. Диастерометрическое разделение глюкуронидов трамадола в образцах in vitro было достигнуто в растворе электролита 10 мМ аммония ацетата - 100 мМ муравьиной кислоты рН 2,75 и 25 мМ тетрабората - 70 мМ раствора натрия додецил сульфата рН 10,45. Оба разделения показали наличие различных количеств продуктов глюкуронизации диастеромеров. Но в реальных образцах мочи, после приёма трамадола глюкурониды диастеромеры обнаружены не были [44].

КЭ с кондуктометрическим детектированием использован для разделения энантиомеров стимуляторов: амфетамина, метамфетамина, эфедрина, псевдоэфедрина, норэфедрина и норпсевдоэфедрина. Оптимальным электролитом для этих целей признана уксусная кислота (рН 2,5 и 2,8) [28]. Признаётся пригодным для хирального разделения энантиомеров и вариант безводного капиллярного электрофореза [38].

Будановой Н. Ю. впервые проведено одновременное разделение энантиомеров 7 карбоксибензильных производных аминокислот. Показано, что метод КЭ позволяет быстро и экономично оценивать энантиораспознавательную способность новых хиральных селекторов и рекомендовать их для создания хиральных неподвижных фаз в ВЭЖХ. Определён энантиомерный состав лекарственных препаратов «Флуксетин» и «Вискен» [4].

Скрининг. Применение КЭ для одновременного скрининга и определения шести производных бензодиазепина в биологических жидкостях представлено Tomita M. с соавт. [73]. Наилучшие электрофореграммы были получены в 5 мМ фосфатном буфере рН 8,5, содержащем 50 мМ натрия додецилсульфата и 15 % метанола. Отмечена высокая чувствительность метода, хорошая воспроизводимость результатов. Методика пригодна для фармацевтического и токсикологического анализа нитрозепама, диазепама, эстазолама и бромазепама, но триазолам и флурозепам могут быть анализированы в биологических жидкостях только на токсическом уровне. Авторы утверждают, что предлагаемая техника может быть полезна для анализа и многих других лекарственных АССОХ в биологических жидкостях. Скрининг кодеина, дигидрокодеина и их глюкуронидов в моче человека проведён с использованием капиллярной сепарационной техники с иммуноанализом флюоресцентной поляризацией и КЭ с масс-спектрометрией. Исследовалась моча после принятия 7 мг кодеина и 25 мг дигидрокодеина. Присутствие свободных и конъюгированных кодеинонов в моче проводилось после ТФЭ. Показана возможность идентификации кодеинонов в моче при концентрации 100 - 200 нг/мл [77].

Для скрининга лекарств в сыворотке и моче современные сепарационные техники КЭ имеют преимущества для использования в токсикологическом анализе. Смеси веществ основного и кислотного характера были анализированы 5 вариантами КЭ [58]. Наиболее эффективными авторы считают КЗЭ, мицеллярную электрокинетическую хроматографию и неводный капиллярый электрофорез. Для экстракции аналитов из сыворотки и мочи для веществ основного характера проводили ТФЭ, ЖЖЭ, а для веществ кислотного характера предпочтительнее ТФЭ.

При сравнении методов исследования Torres-Cartas S. c соавт. [16] считают, что определение сильногидрофобных веществ основного характера методом ВЭЖХ имеет некоторые недостатки, а методы мицеллярной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза могут составить альтернативу ОФ ВЭЖХ. Предметом исследования явилось сравнение методов для определения антипсихотических лекарств (амитриптилин, галопиридол, перфеназин и тиоридазин) в фармацевтических препаратах. Хроматографическое определение проведено на аналитической колонке KromazilC18; 0,04 М цетилтриметиламмония бромида при рН 3,0, содержащий 5 % 1-бутанола, скорость потока 1 мл/мин. КЭ разделение осуществлялось на кварцевом капилляре с буфером 50 мМ tris-(гидроксиметил)-аминометан рН 7,0, 20 кВ, барбитал в качестве внутреннего стандарта. Методы были использованы для определения названных веществ в таблетках и каплях. При сравнении результатов исследования капиллярный электрофорез признан более перспективным для определения сильногидрофобных веществ основного характера.

Приводится сравнительное определение ВЭЖХ и КЭ энантиоразделения цис-дилтиазема гидрохлорида и его метаболита цис-дезацетилдилтиазема. Признавая альтернативность обоих методов, авторы указывают на предпочтение КЭ при определении энантиопримесей в метаболите [15].

Проведена сравнительная оценка различных вариантов КЭ при определении полифенольных антиоксидантов и алкалоидов в чёрном и зелёном чае. Показано, что для одновременного экспрессного определения катехинов и кофеина вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращённой полярностью наиболее предпочтительный [5].

Оптимизация условий КЭ с использованием программного обеспечения применена для разделения и определения антигистаминов в фармацевтических препаратах, в образцах сыворотки и мочи [11]. КЭ, применённый для анализа в волосах запрещённых лекарств, рассматривается как новый инструмент в аналитической токсикологии [12].

Применение метода капиллярного электрофореза может явиться эффективным инструментом для перевода на качественно новый уровень исследований лекарственных АССОХ при фармацевтических, клинико-диагностических и химико-токсикологических анализах.

Рецензенты:

Гейн В. Л, д. х. н., профессор, зав. кафедрой физической и коллоидной химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.

Михайловский А. Г., д. фарм. н., зав.кафедрой неорганической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.