В анализе азотсодержащих соединений основного характера (АССОХ), в том числе лекарственных средств, находит всё более широкое применение, особенно в зарубежной аналитической практике, метод капиллярного электрофореза (КЭ). Принципы, терминология и оценка метода КЭ были показаны нами ранее [7]. Наряду с известными способами детектирования в последнее время получают широкое распространение современные варианты. Описан новый и простой способ определения норфлоксацина, ципрофлоцина и офлаксацина КЭ с хемилюменисцентным детектированием. Методика нашла применение для определения офлоксацина в глазных каплях, норфлоксацина в образцах мочи человека для изучения фармакокинетики препарата [9].
Капиллярный электрофорез - масс-спектрометрия (КЭ/МС) - рекомендована для фармацевтических и биотехнологических исследований [52], использована для разработки методики определения карнитина и ацилкарнитинов (его эфиров), играющих важную роль в метаболизме жирных кислот. По уровню этих компонентов в биологических жидкостях можно судить о нарушении метаболизма при проведении мониторинга. Изолирование из плазмы и мочи проводилось ТФЭ или ЖЖХ.
Лазерный флуорометрический детектор в КЭ, используемый для анализа трамадола [10], морфина [21], был применён и для быстрого анализа фуросемида в моче человека после ТФЭ. Высокая чувствительность методики позволяет определять терапевтические дозы и предложена для контроля мочи спортсменов [14].
Всё более широко применяется электроспрей ионизация масс-спектрометрия. Так, этот способ использован для количественного определения 20 натуральных аминокислот в стандартных микстурах и в детской плазме крови без дериватизации. Предел определения 3 - 20 мМ/л [42].
Метод успешно применён для совместного анализа катехоламинов (допамин, норэпинефрин, эпинефрин) и их О-метокси метаболитов (3-метокситирамин, норметанефрин и метанефрин) в образцах мочи здоровых волонтёров. Для пробоподготовки и концентрирования использованы катионобменные сорбенты [18].
Разработаны и предложены практические рекомендации по увеличению чувствительности скрещено-лучевого термолинзового детектирования в капиллярных электромиграционных методах [2], которые включают использование водно-органических растворов фонового электролита вместо водной среды.
Диодно-матричное детектирование описано для КЭ 2 местных анестетиков (лидокаин и бупивакаин) и 2 опийных алкалоидов носкапин и папаверин в обрацах мочи [41]; десяти амфетаминов в цельной человеческой крови [65].
Неводный КЭ. Кроме водного КЭ, всё более широко развивается направление неводного или безводного КЭ. Применение этого варианта помогает решить проблему КЭ анализа для лекарственных веществ, нерастворимых или труднорастворимых в воде. Использование органических растворителей и их смесей в КЭ заслуживает большого внимания и может широко использоваться в анализе фармацевтических препаратов, стереоизомеров, а также в биологических анализах; имеет преимущества по сравнению с водным КЭ и будущие перспективы [59, 70].
Способ неводного КЭ был применён для анализа энантиомеров салбутанола в моче, после изолирования ТФЭ [48]; катехоламинов после их дериватизации [47]; для алкалоидов: берберина и ятрептизина с использованием приёма стекинга [43] и др.
Метод неводного КЭ с УФ- и электроспрей масс-спектрометрией предложен для одновременного анализа экстази и других производных амфетамина. Наилучшие результаты были получены в смеси ацетонитрил - метанол (80:20) с добавлением 25 мМ аммония формиата, 1М раствора муравьиной кислоты, при 30 кВ и 15 °С. Метод успешно применён для анализа амфетаминов в моче после ЖЖЭ [33].
Описана и валидирована методика определения флуоксетина и его главного метаболита норфлуоксетина неводным КЭ в системе метанол - ацетонитрил, содержащей 15 мМ аммония ацетата при 25° С и 25 кВ. Внутренний стандарт - проксетин. Методика использована для клинических целей при определении уровня концентрации флуоксетина и его метаболита в моче, после ТФЭ, с последующим элюированием веществ метанолом [24].
Быстрый вариант определения 3,4-метилендиоксиметамфетамина неводным КЭ и флюоресцентным детектированием в сочетании с ГХ/МС анализом в моче, после ЖЖЭ полезен и пригоден для использования в судебно-химическом анализе [57].
Возможности неводного КЭ были использованы для разделения смеси тамоксифена, имипрамина и их главных метаболитов (4-гидрокситамоксифен и дезимипрамин) в 17 мМ аммония ацетата и 1,25 % раствора уксусной кислоты (80:20), метанол и ацетонитрил; 15 кВ. Внутренний стандарт - пароксетин. Метод использован в клинической практике для определения их уровня в моче, после изолирования и очиски ТФЭ [46].
Прямое введение без пробоподготовки. Развивается направление прямого исследования пробы КЭ без предварительной экстракции и концентрирования биологических объектов. Прямое определение диуретических лекарств в моче КЭ при флуоресцентном детектировании описано для амилорида, триамтерена, бендрофлуметиазида и буметанида [34]. Методика прямого определения разработана для анализа новых цефалоспориновых антибиотиков (цефалексин, цефсулодин, цефотаксим, цефамандол, цефуроксим, цефодизим) в моче и желчи [19]. КЭ с высокочувствительным Z капилляром предложен для анализа тиамина в биологических средах (плазма, моча, слюна). Образцы мочи разбавляли водой 1:1 и напрямую вводили в прибор. Образцы плазмы предварительно обрабатывали ацетонитрилом (1:3) для осаждения белков [45].
Приём стекинга. Чувствительность метода КЭ может быть существенно повышена за счёт концентрирования образца непосредственно в капилляре. Одним из наиболее общих подходов к увеличению концентрационной чувствительности в КЭ является приём стекинга.
Стекинг был применён для анализа амитриптилина и его метаболита нортриптилина КЭ в плазме человека. Буфер - Tris (1,4 М рН 4,5), содержащий β- циклодекстрин 1 мМ и 50 % (v/v)этиленгликоля. Методика использована для анализа реальных образцов крови пациента и для изучения фармакокинетики амитриптилина [49]. Комбинация КЭ и масс-спектрометрии в сочетании с ТФЭ использована для идентификации никотина и его метаболитов в моче. Приём стекинга позволил определить никотин и котинин по этой технике в моче курильщиков 0,55 и 11,25 нг/мл соответственно [22]. КЭ с использованием стекинга был применён для определения метформина в плазме. Внутренним стандартом служил фенформин. Буфер - 0,1 М фосфатный рН 2,5, 20 кВ. УФ-детектирование при 195 нм. Предел определения 0,25 мкг/мл. Концентрация метформина в плазме была исследована у 8 волонтёров после приёма препарата в капсулах или таблетках [20].
КЭ с приёмом стекинга описан для совместного определения клозапина и его метаболитов клозапин N-оксида и дезметилклозапина в плазме больных шизофренией. 0,2 мл плазмы экстрагировали смесью этилацетата - н-гексана - изопропанола 8:1:1. После центрифугирования аликвоту упаривали и реконструировали водой для КЭ анализа. Буфер фосфатный рН 3,0, содержащий 50 % этиленгликоля; 25 кВ, детекция при 214 нм. После длительного применения клозапина таблеток образцы крови больных анализировали. Определяемый уровень клозапина и его метаболитов позволяет рекомендовать метод в клинической практике [31]. В развитие идеи стекинга предложен новый метод on-line концентрирования при капиллярно-электрофоретическом определении аминов и аминокислот [6].
Фармпрепараты. КЭ имеет первостепенное значение для разработки методик разделения, идентификации и количественного определения лекарственных АССОХ в фармацевтических препаратах и был применён для определения леводопы и карбидола в сложных таблетках [61]; цефалоспоринов в растворе для инъекций [51]; энантиомеров трамадола [68]; для разделения энантиомеров атропина [29]; хиральных композиций в таблетках пенициллина [67]; при определении субстанций, относящихся к героину [74]. Методика качественного и количественного определения водорастворимых витаминов в витамино-минеральных комплексах методом КЭ разработана Богачук М. Н. с соавторами [3].
КЗЭ использован для разделения 6 антидепрессантов (кломипрамин, пароксетин, флуоксенин, цитолопрам, флуоксетин, и тразадон). Оптимальные условия: раствор электролита, содержащий 50мМ фосфатного буфера при рН 2,0; 25кВ. Предел обнаружения в интервале 0,03 до 11 мг/л. Методика валидирована по основным показателям и проверена в условиях анализа фармацевтических препаратов [25]. Для анализа и определения стабильности 14 цефалоспориновых антибиотиков в воде при различных температурах (+25о, +4 о и -18 о) применяли КЭ. Установлено, что деградация большинства цефалоспоринов не выше 20 % при комнатной температуре в течение 4 часов [32].
Suntornsuk L. [69] высказывает мнение о значении КЭ для развития производства лекарств и потенциально большом будущем этого метода в связи с высокой чувствительностью и эффективностью. Демонстрируется применение КЭ в фармацевтическом анализе, включая принципы, приборы и направления использования. Предложен новый подход к классификации вариантов КЭ.
Примеси. Капиллярный электрофорез применяется при определении нелетучих примесей в лекарственных АССОХ и фармацевтических препаратах. Рекомендована методика капиллярного электрофореза для определения N-метилпирролидина в качестве примеси и продукта деградации в цефепине гидрохлориде - субстанции для инъекций. Использован УФ-фотометрический вариант определения аналита при 240 нм, кварцевый капилляр, электролит - 5 мМ имидазола рН 5,1 с 3 М раствором уксусной кислоты, 25 кВ при температуре 25 оС [76]. МС детектор использован при определении D-карнитина в качестве энантиопримеси левокарнитина в фармацевтических препаратах [60]. Для отделения кислотных и основных примесей успешно использован безводный КЭ с масс- спектрометрическим детектированием [71].
Подходы к определению качества и безопасности лекарственных средств на основе методов низкомолекулярного гепарина, а также его примесей рассмотрены Ариановой Е. А. с соавторами [1].
Биологические жидкости. Из объектов анализа КЭ на АССОХ чаще используются биологические жидкости и прежде всего моча: для определения триамтерена, метотрексата и креатинина [13]; диуретиков - индапамида, гидрохлоротиазида и буметамида без преконцентрации проб с приёмом стекинга [8, 69]; катехоламинов и метанефринов [18]; хинолон-антибиотиков [40]; психотропных лекарств [39].
Важным направлением является определение КЭ метаболитов в моче: бупивакаина и его метаболитов [17]; омепразола и его метаболита 5-гидроксиомепразола [27]; совместный анализ кокаина и его метаболитов [62, 63]; антипсихотических лекарств (клозепин, локсапин) и их метаболитов [55]; офлоксацина и его метаболитов дезметилофлоксацина и офлоксацина N-оксида после прямого введения пробы в капилляр [36].
Тандем КЭ/электроспрей ионизации масс-спектрометрии применён для изучения процессов метаболизма нейролептика галопиридола и может быть использован как инструмент аналитичекой диагностики [37].
КЭ при анализе плазмы был применён для определения: морфина без предварительной пробоподготовки [50]; сульфаметаксазола и триметоприна [64]; в сыворотке был анализирован ламивудин [30] и трициклические антидепрессанты [26].
Для определения лидокаина и его метаболитов в плазме применён неводный КЭ, УФ- и МС-детектирование [75]. Проведено определение метаболитов кокаина в пятнах крови, в следах пота и волосах [66].
Количественный биоанализ лекарственных энантиомеров проведён в плазме в тандеме КЭ и МС. Оптимизированы условия для фармакологического исследования [56]. Проведён терапевтический мониторинг антидепрессантов КЭ в биологических жидкостях с целью выяснения влияния веществ и их метаболитов на лечение депрессивных состояний [53]. Использование тандема КЭ/масс-спектрометрия и КЭ/электроспрей ионизация масс-спектрометрия позволяет определять морфин и опиоиды, их глюкурониды с целью мониторинга и токсикологического контроля мочи [78]. Образцы крови и мочи пациентов с различными метаболическими нарушениями анализировали КЭ. Наиболее высокую чувствительность показал вариант КЭ-МС-МС и рекомендован для проведения мониторинга как инструмент аналитической диагностики [54].
Энантиомеры. Hempel G., Blaschke G. [35] предложена методика стереоселективного определения зопиклона и его главных метаболитов в моче. После добавления внутреннего стандарта (золпидем) образцы мочи экстрагировали при рН 8 смесью хлороформ - изопропанол и аналиты анализировали КЭ с β-циклодекстрином в качестве хирального селектора, используя УФ-лазерно-флуоресцентное детектирование при 325 нм. Исследованы образцы мочи двух волонтёров после перорального применения 7,5 мг зопиклона. Энантиомеры зопиклона были количественно определены в слюне.
КЭ с УФ-детектированием был использован для изучения миграционного поведения и разделения трамадола, его 5 изомеров и 3 метаболитов - глюкуронидов. Разделение трамадола и всех аналитов проведено с использованием 65 мМ тетрабората при рН 10,65 в качестве электролита. Проведён скрининг реальных образцов мочи (после приёма разовой дозы 50 мг трамадола). После ТФЭ трамадол и его метаболиты были детектированы на электрофореграмме в сравнении со стандартами. Диастерометрическое разделение глюкуронидов трамадола в образцах in vitro было достигнуто в растворе электролита 10 мМ аммония ацетата - 100 мМ муравьиной кислоты рН 2,75 и 25 мМ тетрабората - 70 мМ раствора натрия додецил сульфата рН 10,45. Оба разделения показали наличие различных количеств продуктов глюкуронизации диастеромеров. Но в реальных образцах мочи, после приёма трамадола глюкурониды диастеромеры обнаружены не были [44].
КЭ с кондуктометрическим детектированием использован для разделения энантиомеров стимуляторов: амфетамина, метамфетамина, эфедрина, псевдоэфедрина, норэфедрина и норпсевдоэфедрина. Оптимальным электролитом для этих целей признана уксусная кислота (рН 2,5 и 2,8) [28]. Признаётся пригодным для хирального разделения энантиомеров и вариант безводного капиллярного электрофореза [38].
Будановой Н. Ю. впервые проведено одновременное разделение энантиомеров 7 карбоксибензильных производных аминокислот. Показано, что метод КЭ позволяет быстро и экономично оценивать энантиораспознавательную способность новых хиральных селекторов и рекомендовать их для создания хиральных неподвижных фаз в ВЭЖХ. Определён энантиомерный состав лекарственных препаратов «Флуксетин» и «Вискен» [4].
Скрининг. Применение КЭ для одновременного скрининга и определения шести производных бензодиазепина в биологических жидкостях представлено Tomita M. с соавт. [73]. Наилучшие электрофореграммы были получены в 5 мМ фосфатном буфере рН 8,5, содержащем 50 мМ натрия додецилсульфата и 15 % метанола. Отмечена высокая чувствительность метода, хорошая воспроизводимость результатов. Методика пригодна для фармацевтического и токсикологического анализа нитрозепама, диазепама, эстазолама и бромазепама, но триазолам и флурозепам могут быть анализированы в биологических жидкостях только на токсическом уровне. Авторы утверждают, что предлагаемая техника может быть полезна для анализа и многих других лекарственных АССОХ в биологических жидкостях. Скрининг кодеина, дигидрокодеина и их глюкуронидов в моче человека проведён с использованием капиллярной сепарационной техники с иммуноанализом флюоресцентной поляризацией и КЭ с масс-спектрометрией. Исследовалась моча после принятия 7 мг кодеина и 25 мг дигидрокодеина. Присутствие свободных и конъюгированных кодеинонов в моче проводилось после ТФЭ. Показана возможность идентификации кодеинонов в моче при концентрации 100 - 200 нг/мл [77].
Для скрининга лекарств в сыворотке и моче современные сепарационные техники КЭ имеют преимущества для использования в токсикологическом анализе. Смеси веществ основного и кислотного характера были анализированы 5 вариантами КЭ [58]. Наиболее эффективными авторы считают КЗЭ, мицеллярную электрокинетическую хроматографию и неводный капиллярый электрофорез. Для экстракции аналитов из сыворотки и мочи для веществ основного характера проводили ТФЭ, ЖЖЭ, а для веществ кислотного характера предпочтительнее ТФЭ.
При сравнении методов исследования Torres-Cartas S. c соавт. [16] считают, что определение сильногидрофобных веществ основного характера методом ВЭЖХ имеет некоторые недостатки, а методы мицеллярной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза могут составить альтернативу ОФ ВЭЖХ. Предметом исследования явилось сравнение методов для определения антипсихотических лекарств (амитриптилин, галопиридол, перфеназин и тиоридазин) в фармацевтических препаратах. Хроматографическое определение проведено на аналитической колонке KromazilC18; 0,04 М цетилтриметиламмония бромида при рН 3,0, содержащий 5 % 1-бутанола, скорость потока 1 мл/мин. КЭ разделение осуществлялось на кварцевом капилляре с буфером 50 мМ tris-(гидроксиметил)-аминометан рН 7,0, 20 кВ, барбитал в качестве внутреннего стандарта. Методы были использованы для определения названных веществ в таблетках и каплях. При сравнении результатов исследования капиллярный электрофорез признан более перспективным для определения сильногидрофобных веществ основного характера.
Приводится сравнительное определение ВЭЖХ и КЭ энантиоразделения цис-дилтиазема гидрохлорида и его метаболита цис-дезацетилдилтиазема. Признавая альтернативность обоих методов, авторы указывают на предпочтение КЭ при определении энантиопримесей в метаболите [15].
Проведена сравнительная оценка различных вариантов КЭ при определении полифенольных антиоксидантов и алкалоидов в чёрном и зелёном чае. Показано, что для одновременного экспрессного определения катехинов и кофеина вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращённой полярностью наиболее предпочтительный [5].
Оптимизация условий КЭ с использованием программного обеспечения применена для разделения и определения антигистаминов в фармацевтических препаратах, в образцах сыворотки и мочи [11]. КЭ, применённый для анализа в волосах запрещённых лекарств, рассматривается как новый инструмент в аналитической токсикологии [12].
Применение метода капиллярного электрофореза может явиться эффективным инструментом для перевода на качественно новый уровень исследований лекарственных АССОХ при фармацевтических, клинико-диагностических и химико-токсикологических анализах.
Рецензенты:
Гейн В. Л, д. х. н., профессор, зав. кафедрой физической и коллоидной химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.
Михайловский А. Г., д. фарм. н., зав.кафедрой неорганической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.