Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ANALYSIS OF ALLELES FREQUENCIES OF CANDIDATE GENES IN ROSTOV-ON-DON

Miktadova A.V. 1 Kovalenko K.A. 1 Baronyan E.S. 1 Mashkina E.V. 1 Shkurat T.P. 1
1 Southern Federal University
The frequencies of 8 alleles candidate genes associated with risk of development of cardiovascular diseases was investigated in three age groups. Polymorphic alleles of AGT, IТGB3, FII, FV, and also folate cycle genes MTHFR, MTRR and MTR were investigated. The differences of alleles and genotype frequencies were revealed for polymorphism T1311S of AGT between the age groups of inhabitants of Rostov-on-Don. The proportion of heterozygous carriers of the polymorphism is reduced in the age group 19 - 30 years. The proportion of homozygotes 1311CC increased almost 3-fold compared with the younger group of people (10 - 18 years). A combined analysis of the two angiotensinogen gene polymorphisms showed that among persons aged 19 to 30 years more than in the first age group of carriers of both variants of angiotensinogen gene (31.2% and 18.5%, respectively, χ2 = 11,06 P = 0.004). Differences in allele and genotype frequencies between the three age groups were not found for other polymorphisms.
MTHFR and MTRR genes
AGT gene
heart diseases
gene polymorphism
Введение

Развитие мультифакторных заболеваний является результатом аддитивного действия многих факторов, как эндогенных, так и экзогенных. Носительство полиморфизмов генов-кандидатов определяет уникальный биохимический профиль человека, что лежит в основе наследственной предрасположенности к развитию мультифакторной патологии. В патогенезе целого ряда мультифакторных заболеваний ведущую роль играют нарушения системы гемостаза, одной из причин которых может быть носительство полиморфных вариантов генов фолатного цикла, ренин-ангиотензиновой системы, факторов свертывающей системы крови. В качестве одной из причин развития тромбофилии рассматривают гипергомоцистеинемию, обусловленную, в частности, мутациями генов фолатного обмена. Избыток гомоцистеина способствует активации XII и V факторов; при этом нарушается высвобождение естественных ингибиторов свертывания и антиагрегантов, снижается активация антитромбина III, подавляется активность тромбомодулина, наблюдается повышенная агрегация тромбоцитов [4, 7]. Данные атерогенные и тромбофилические эффекты в совокупности определяют хроническую эндотелиальную дисфункцию. На сегодняшний день показана возможность возникновения гипергомоцистеинемии и связанных с ней патологических состояний в результате нарушения функции ферментов, участвующих в фолатном обмене - метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионинсинтазы редуктазы (MTRR) и метионинсинтазы (MTR).

Носительство полиморфных вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы и факторов свертывающей системы крови у человека ассоциируется с повышенным риском развития ряда мультифакторных заболеваний. Одним из объяснений влияния ренин-ангиотензиновой системы на развитие сердечно-сосудистой патологии является представление о последствиях повышения активности ангиотензиногена II. В гене ангиотензиногена существует более 30 аллельных вариантов. Наличие аллелей 521Т и 1311С приводит к существенному повышению уровня ангиотензиногена в плазме, что вызывает увеличение содержания ангиотензина II. 1311С-полиморфизм гена ангиотензиногена повышает систолическое и диастолическое давление, в 1,25 раза увеличивает количество атеросклеротических бляшек [8]. По некоторым данным полиморфизмы С521Т и Т1311С гена AGT являются маркерами гипертонии, инфаркта.

Лица с наследственной предрасположенностью имеют повышенный по сравнению с популяционным риск развития мультифакторных заболеваний. Однако его степень определяется сложным взаимодействием совокупности генетических и средовых факторов. Длительность воздействия неблагоприятных факторов среды вносит свой вклад в развитие мультифакторного заболевания. Целью данной работы было определить частоту регистрации полиморфизмов 677C-T (db SNP ID: rs1801133) гена MTHFR (MIM *607093), 66A-G (db SNP: rs1801394) гена MTRR (MIM *602568), 2756A-G гена MTR (MIM *156570), 1311T-C (db SNP: rs699) и 521С-Т гена AGT (MIM +106150), 1565T-C (db SNP: rs5918) гена интегрина β-3 ITGB3 (MIM +173470), 20210G-A коагуляционного фактора F II (MIM +176930), 1691G-A (db SNP: rs6025) коагуляционного фактора F V (MIM *612309) в трех возрастных группах жителей Ростова-на-Дону.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили образцы ДНК, полученные из лейкоцитов периферической крови жителей Ростова-на-Дону, которые подписали информированное согласие об участии в исследовании (сами или их родители). Первую возрастную группу составили лица в возрасте от 10 до 18 лет (140 человек); вторая возрастная группа (19 - 30 лет) - 98 человек; третья возрастная группа - лица в возрасте от 31 до 45 лет (52 человека). Работу проводили на базе НИИ биологии Южного федерального университета.

Для выделения ДНК использовали набор реагентов DIAtomTM DNA Prep 100 (ООО Центр Молекулярной Генетики). Полиморфизмы генов: ангиотензиногена, тромбоцитарного рецептора фибриногена (интегрина β3), метилентетрагидрофолатредуктазы, метионинсинтазы редуктазы, метионинсинтазы, коагуляционного фактора II и коагуляционного фактора V исследовали с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Москва). Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3 % агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad).

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программного пакета MS Excel. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди - Вайнберга определяли по стандартным формулам. Оценку различий в распределении полиморфных вариантов генов в обследованных группах осуществляли по критерию χ2 при помощи программы BIOSTAT.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате исследования установлено, что в младшей возрастной группе 30,7 % лиц являются гетерозиготными носителями полиморфизма C521T ангиотензиногена, а гомозиготный вариант полиморфизма зафиксирован в 1,4 % случаев (табл. 1). Во второй и третьей возрастных группах частота регистрации гомозигот 521TT гена AGT составила 4,1 и 3,8 % соответственно. Общий характер распределения частот генотипов в трех возрастных группах одинаков.

Таблица 1. Частота генотипов (%) и аллелей гена ангиотензиногена в трех возрастных группах жителей Ростова-на-Дону

Ген, полиморфизм

Возраст 10 - 18 лет, абс. (%)

Возраст 19 - 30 лет, абс. (%)

Возраст 31 - 45 лет, абс. (%)

χ22 (P)

AGT С521T

СС

95 (67.9%)

69 (70.4%)

33 (63.5%)

 

0.87 (0.65)

СТ

43 (30.7%)

25 (25.5%)

17 (32.7%)

ТТ

2 (1.4%)

4 (4.1%)

2 (3.8%)

Частота аллели 521Т

0.168

0.168

0.202

 

χ21 (Р)

 

2.21 (0.33)

1.22 (0.54)

 

AGT Т1311С

ТТ

44 (31.4%)

27 (27.6%)

15 (28.8%)

 

2.43 (0.3)

ТС

80 (57.1%)

41 (41.8%)

27 (51.9%)

СС

16 (11.4%)

30 (30.6%)

10 (19.2%)

Частота аллели 1311С

0.4

0.515*

0.452

 

χ21 (Р)

 

13.92 (0.001)

1.97 (0.37)

 

Примечание: χ21 - сравнение с возрастной группой 10 - 18 лет; χ22 - сравнение возрастной группы 19 - 30 лет с возрастной группой 31 - 45 лет; * - статистически значимые отличия по сравнению с первой возрастной группой

Доля носителей полиморфизма T1311C гена ангиотензиногена в младшей возрастной группе составила 57,1 %, а гомозигот 1311CC - 11,4 % (табл. 1). Во второй возрастной группе количество гетерозигот снижается, а доля гомозигот 1311CC повышается по сравнению с первой группой. Среди лиц старше 30 лет характер распределения частот генотипов по полиморфизму T1311C ангиотензиногена не отличается от первой возрастной группы. Сочетанный анализ носительства двух полиморфизмов гена ангиотензиногена показал, что среди лиц в возрасте от 19 до 30 лет больше по сравнению с первой возрастной группой носителей обоих вариантов гена ангиотензиногена (31,2 % и 18,5 % соответственно, χ2 = 11,06 Р = 0,004).  

Анализ частот исследуемых аллелей показал, что среди жителей Ростова-на-Дону аллель 1311С гена AGT регистрируется более чем в 2 раза чаще по сравнению с аллелью 521Т (табл. 1). Во второй возрастной группе частота аллели 1311С гена ангиотензиногена отличается от данного показателя для первой возрастной группы (χ2 = 6,2 Р = 0,01).

Носительство полиморфизма Т1565С гена интегрина β-3 ассоциировано с повышенным риском развития ряда сердечно-сосудистых заболеваний, особенно при сочетании с некоторыми вредными факторами среды и вредными привычками [1-3, 5]. Интегрин αIIb3 является поверхностным рецептором тромбоцитов, который обеспечивает связывание с фибриногеном. В исследуемой нами выборке жителей Ростова-на-Дону гомозигот по полиморфизму 1565СС гена ITGB3 не обнаружено. Однако доля гетерозиготных носителей данного варианта гена высока и составляет 28 - 35 % (табл. 2).

Таблица 2. Частота генотипов (%) и аллелей генов факторов свертывающей системы и интегрина β-3 в трех возрастных группах жителей Ростова-на-Дону

Ген, полиморфизм

Возраст 10 - 18 лет, абс. (%)

Возраст 19 - 30 лет, абс. (%)

Возраст 31 - 45 лет, абс. (%)

χ22 (P)

F II G20210A

GG

137 (97.9 %)

96 (98.0 %)

51 (98.1 %)

 

0 (1.0)

GA

3 (2.0 %)

2 (2.1 %)

1 (1.9 %)

Частота аллели 20210A

0.011

0.01

0.01

 

χ21 (Р)

 

0 (1.0)

0.01 (1.0)

 

F V G1691A

GG

134 (95.7 %)

95 (96.9 %)

47 (90.4 %)

 

2.89 (0.24)

GA

6 (4.3 %)

3 (3.1 %)

5 (9.6 %)

Частота аллели 1691A

0.021

0.015

0.048

 

χ21 (Р)

 

0.24 (0.89)

1.99 (0.37)

 

ITGB3 T1565C

TT

99 (70.7 %)

70 (71.4 %)

34 (65.4 %)

 

0.58 (0,75)

TC

41 (29.3 %)

28 (28.6 %)

18 (34.6 %)

Частота аллели 1565C

0.146

0.14

0.17

 

χ21 (Р)

 

0.01 (0.99)

0.51 (0.78)

 

Примечание: χ21 - сравнение с возрастной группой 10 - 18 лет; χ22 - сравнение возрастной группы 19 - 30 лет с возрастной группой 31 - 45 лет.

Гетерозиготное носительство точечной замены G1691A в гене F V выявлено у 3,1 - 9,6 % лиц, гомозиготный вариант полиморфизма зафиксирован не был. Наибольшее количество гетерозигот G1691A по гену F V выявлено среди лиц старше 30 лет (табл. 2). Гомозиготных носителей полиморфного варианта гена F II также не выявлено (табл. 2). Доля гетерозигот в среднем составляет около 2 %.

При сочетанном анализе носительства исследуемых полиморфизмов генов AGT, IТGB3 и коагуляционных факторов F II, F V установлено, что во второй возрастной группе преобладают носители одного из исследуемых полиморфизмов - гетерозиготы Т1311С гена ангиотензиногена. Около 10 % лиц данной группы являются носителями обоих вариантов гена AGT (гетерозиготность С521Т сочетается с гомозиготностью по аллели  1311С). В 7 % случаев две данных аллели находятся в гетерозиготном состоянии; еще 7 % лиц являются гомозиготами 1311СС гена ангиотензиногена. У 5,6 % обследованных выявлено сочетание гомозиготы по 1311С аллели гена AGT с гетерозиготным состоянием по полиморфизму Т1565С гена тромбоцитарного рецептора фибриногена. Другие аллельные сочетания встречаются в единичных случаях.

В старшей возрастной группе доля лиц, имеющих только полиморфизм Т1311С гена ангиотензиногена, составила 16,9 %. В два раза меньше лиц имеют два варианта полиморфизма гена ангиотензиногена в гетерозиготном состоянии. В 7,2 % случаев выявлено сочетанное носительство полиморфизма Т1565С гена тромбоцитарного рецептора фибриногена и 1311С гена ангиотензиногена. Остальные варианты генотипов представлены в единичных случаях.

Анализ аллелей генов фолатного цикла показал, что 47,9 % детей являются гетерозиготными носителями полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы, а гомозиготный вариант 677ТТ зафиксирован в 7,1 % случаев (табл. 3). Во второй и третьей возрастных группах характер распределения частот генотипов по данному варианту гена не отличается. По данным литературы известно, что наличие полиморфизма 677Т ассоциировано со снижением активности фермента MTHFR и приводит к накоплению гомоцистеина в крови [9].

Таблица 3. Частоты генотипов (%) и аллелей по исследуемым полиморфизмам генов фолатного цикла среди жителей Ростова-на-Дону

Ген, полиморфизм

Возраст 10 - 18 лет, абс. (%)

Возраст 19 - 30 лет, абс. (%)

Возраст 31 - 45 лет, абс. (%)

χ22 (P)

MTHFR C677T

CC

63 (45.0 %)

45 (45.9 %)

23 (44.2 %)

 

0.36 (0.84)

CT

67 (47.9 %)

43 (43.9 %)

22 (42.3 %)

TT

10 (7.1 %)

10 (10.2 %)

7 (13.5 %)

Частота аллели 677Т

0.31

0.32

0.34

 

χ21 (Р)

 

1.97 (0.37)

0.85 (0.65)

 

MTRR A66G

AA

31 (22.1 %)

20 (20.4 %)

9 (17.3 %)

 

0.27 (0.87)

AG

60 (42.9 %)

49 (50.0 %)

28 (53.8 %)

GG

49 (35.0 %)

29 (29.6 %)

15 (28.8 %)

Частота аллели 66G

0.56

0.54

0.55

 

χ21 (Р)

 

1.24 (0.54)

1.86 (0.4)

 

MTR A2756G

AA

89 (63.6 %)

56 (57.1 %)

33 (63.5 %)

 

1.77 (0,41)

AG

48 (34.3 %)

36 (36.7 %)

14 (26.9 %)

GG

3 (2.1 %)

6 (6.1 %)

5 (9.6 %)

Частота аллели 2756G

0.19

0.24

0.23

 

χ21 (Р)

 

2.9 (0.23)

5.72 (0.06)

 

Примечание: χ21 - сравнение с возрастной группой 10 - 18 лет; χ22 - сравнение возрастной группы 19 - 30 лет с возрастной группой 31 - 45 лет.

Доля гетерозигот по аллели A66G метионин-синтазы-редуктазы среди детей Ростова-на-Дону составила 42,9 %, а гомозигот - 35 % (табл. 3). Общий характер распределения частот генотипов по полиморфизму A66G гена MTRR среди второй и третьей возрастных групп сходен с таковым для младшей группы. В целом, около половины лиц являются гетерозиготными носителями варианта A66G гена MTRR, около 30 % приходится на гомозиготных носителей данного полиморфизма. Одной из главных функций фермента метионин-синтазы-редуктазы является обратное превращение гомоцистеина в метионин. Изменение функционирования фермента MTRR может приводить к гипергомоцистенемии, что имеет отрицательное воздействие на организм и способствует возникновению тромбозов.

Полиморфизм гена метионин-синтазы в гетерозиготном состоянии выявлен у 34,3 % лиц до 19 лет, а в гомозиготном - в 2,1 % случаев (табл. 3). Наибольшее количество гомозигот (9,6 %) 2756GG гена MTR выявлено среди лиц старше 30 лет. Среди лиц всех возрастов преобладают гомозиготы по нормальной аллели метионин-синтазы. Таким образом, среди трех генов фолатного цикла наибольшей частотой регистрации полиморфизма характеризуется ген метионинсинтазы редуктазы; реже всего выявляется полиморфизм гена метионинсинтазы (табл. 3).

Нами был проведён сочетанный анализ носительства полиморфизмов трех генов фолатного цикла. В трех возрастных группах от 13,8 до 18 % лиц являются гетерозиготами только по полиморфизму гена MTRR. 12 % лиц являются одновременно гетерозиготами по полиморфизмам двух генов - MTHFR и MTRR. 11,5 % детей являются гомозиготами 66GG гена MTRR; при этом в других исследуемых генах полиморфизмов не обнаружено. Среди лиц старше 19 лет данный показатель не превышает 6 %. Только 6 % обследованных лиц трех возрастных групп не имеют ни одного исследуемого полиморфизма генов фолатного цикла.

Проанализировав в целом частоту регистрации гетерозигот и гомозигот по всем исследуемым полиморфизмам генов, установлено, что среди лиц младшей возрастной группы 19,4 % лиц имеют не более 2 исследуемых вариантов полиморфизма. По 37 - 38 % лиц имеют либо 3-4 либо 5-6 аллелей с измененной нуклеотидной последовательностью. В единичных случаях в первой и второй возрастных группах выявлены лица с 7 и 8 исследуемыми вариантами полиморфизма. Одновременное выявление нескольких генетических факторов предрасположенности значительно увеличивает риск развития мультифакторных заболеваний. Полученные в результате исследования данные показали, что большинство лиц, являющихся носителями нескольких исследуемых полиморфизмов генов-кандидатов, также имеют родственников с тромбоэмболическими заболеваниями.

Развитие мультифакторного заболевания является результатом аддитивного действия нескольких генов. Риск развития заболевания повышается с увеличением количества полиморфизмов в генах-кандидатах. Известно, что при одновременном носительстве двух полиморфизмов С521Т, Т1311С гена AGT риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний увеличивается. Гетерозиготные носители Лейденской мутации обладают повышенной склонностью к развитию сосудистых тромбозов, являющихся фактором риска венозных и артериальных тромбоэмболий. Сочетание Лейденской мутации F V и термолабильной мутации MTHFR увеличивает риск развития венозных тромбозов. В то же время наличие полиморфизмов не является абсолютно «фатальным» и лишь формирует определенный генетический фон, специфический для каждого человека и определяющий взаимоотношения с другими факторами. Например, установлено, что проявление полиморфизма гена ангиотензиногена, возможно, зависит от пола. Показано, что женщины с генотипом 1311СС AGT достоверно реже заболевают гипертензией по сравнению с мужчинами с таким же генотипом [6]. Возможно, что это связано с особенностями контроля экспрессии гена. Известно, что ангиотензиноген экспрессируется под контролем эстрогенов, глюкокортикоидов и тиреоидных гормонов. Тестирование аллельных маркеров и возможная фенотипическая корректировка их функционального проявления могут существенно уменьшить число лиц, у которых реально разовьется заболевание. Досимтоматическое выявление индивидов групп высокого риска по мультифакторной патологии обеспечивает возможность ее первичной профилактики.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ФЦП «Проведение центром коллективного пользования научным оборудованием «Высокие технологии» Южного федерального университета поисковых научно-исследовательских работ в области создания экологически чистых технологий получения новых активных нано- и микроструктурированных материалов для использования в современной сенсорике», госконтракт № 16.552.11.7024.

Рецензенты:

  • Амелина Светлана Сергеевна, доктор медицинских наук, заведующая отделом биомедицины НИИ биологии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону.
  • Усатов Александр Вячеславович, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом изменчивости генома НИИ биологии Южного федерального университета,  г. Ростов-на-Дону.