Несмотря на большой интерес исследователей к этим препаратам, мембраностабилизирующий эффект их липосомальных форм мало изучен.
Цель исследования: Изучить влияние липосомальных форм α-токоферола, дигидрокверцетина и эмоксипина на резистентность эритроцитов к осмотическому гемолизу.
Материалы и методы исследования
Получение эритроцитов. Эритроциты выделяли из крови доноров центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Эритроциты троекратно отмывали от плазмы в 0,9 % растворе натрия хлорида. Полученную эритроцитарную массу разбавляли забуференным физиологическим раствором до получения 5 % взвеси по объему. Забуференный физиологический раствор содержал 0,15 М натрия хлорида и 0,01 М натрий- фосфатного буферного раствора, рН 7,4.
Приготовление липосом. Липосомы готовили методом экструзии (экструдер Lipex Biomembranes Inc. Canada) через поликарбонатные фильтры. Перед экструзией получали липидную пленку необходимого состава на стенках колбы ротационного испарителя, используя хлороформ в качестве растворителя. Полученную пленку гидратировали раствором внутренней фазы и встряхивали до образования мультиламмелярных везикул. Для улучшения гидратации везикулы подвергали десятикратному циклу замораживания-оттаивания. Полученную суспензию пропускали через экструдер с использованием поликарбонатных фильтров (Costar, USA) с размером пор 100 нм.
В экспериментах использовали «пустые» липосомы (ПЛ), содержащие в липидной фазе лецитин и холестерин в молярном отношении 7:5, и липосомы, дополнительно содержащие антиоксиданты: α-токоферол (α-ТФЛ), дигидрокверцетин (ДГКЛ) или эмоксипин (ЭМОЛ). Все антиоксиданты добавляли из расчета 0,25 ммоль/г липида. При получении липосом с α-токоферолом и дигидрокверцетином их добавляли в колбу на этапе формирования липидной пленки. Эмоксипин добавляли в виде водного раствора на стадии гидратации липидной пленки.
Инкубация эритроцитов с липосомами. К 5 мл 5 % взвеси эритроцитов добавляли липосомы и инкубировали в закрытых пробирках при температуре 37 °С и щадящем режиме перемешивания в течение 24 часов. Концентрация липосом в пробах в пересчете на липиды составила 10 мг/л (14,8 мкМ) с содержанием антиоксидантов 2,5 мкМ. В контрольной группе вместо липосом использовали равный объем физиологического раствора.
Исследование осмотического гемолиза эритроцитов. Для определения процента гемолиза 0,4 мл 5 % эритроцитарной взвеси добавляли к 2 мл гипоосмотического раствора хлорида натрия. Для каждого образца оценивали гемолиз эритроцитов в 0,3 %, 0,4 % и 0,5 % растворах NaCl. Затем взвесь центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин и супернатанте измеряли оптическую плотность при длине волны поглощения гемоглобина 535 нм на спектрофотометре Genesys (Thermo, США). На основании полученных данных рассчитывали процент гемолизированных эритроцитов, принимая за 100 % гемолиз результат после добавления к взвеси эритроцитов капли 4 % водного раствора сапонина.
Статистическую обработку результатов выполняли в программе Statistica 6.0 с расчетом значения среднего арифметического и стандартной ошибки. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты сравнительной оценки осмотической устойчивости свежевыделенных эритроцитов и эритроцитов после 24-часовой инкубации в забуференном физиологическом растворе при температуре 37 оС приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что инкубация эритроцитов в солевой изотоничной среде в течение суток ухудшает состояние клеточных мембран, что проявляется в снижении осмотической резистентности эритроцитов при всех концентрациях гипоосмотических растворов NaCl.
Таблица 1 Осмотическая устойчивость эритроцитов до и после 24-часовой инкубации в нормотермическом забуференном физиологическом растворе при различных внешних концентрациях хлорида натрия
|
|
Гемолиз эритроцитов в гипоосмотических растворах NaCl |
||
|
0,3% NaCl |
0,4% NaCl |
0,5% NaCl |
|
|
Свежевыделенные эритроциты |
82,8±4,2 |
56,8±2,8 |
0 |
|
Эритроциты через 24 часа инкубации |
99,4±4,1* |
66,1±2,4* |
9,2±0,52* |
Примечение: * - достоверность различий относительно значений свежевыделенных эритроцитов при р<0,05.
Введение липосом в состав среды для инкубации увеличивал осморезистентность эритроцитов (рис. 1). Липосомы, состоящие только из лецитина и холестерина, и липосомы с включением α-токоферола в условиях нашего эксперимента проявляли слабый защитный эффект по отношению к гемолизу. Хотя токоферол рассматривается как важнейший универсальный природный антиоксидант для клеточных мембран [3, 6], его активность оказалась недостаточной для получения заметного мембраностабилизирующего действия, и его эффективность в наших экспериментах была близка к эффективности мембранных липидов липосом. В группах ПЛ и α-ТФЛ повышение устойчивости эритроцитов к гемолизу отмечено только при концентрации гипоосмотического раствора NaCl 0,3 %.
Липосомы, содержащие вещества, обладающие высокой антиоксидантной активностью - дигидрокверцетин и эмоксипин, проявляли выраженный мембраностабилизирующий эффект по отношению к осмотическому гемолизу при всех применявшихся концентрациях NaCl, несмотря на различия физико-химических свойств. В силу очень плохой растворимости в воде дигидрокверцетин локализуется в липосомах в их липидной части, а эмоксипин, в силу гидрофильности, во внутренней части в виде водного раствора. Однако несмотря на разницу в локализации и различия в химической природе, оба вещества проявляют близкие по значениям показатели снижения осмотического гемолиза эритроцитов после 24-часовой инкубации. При использовании этих антиоксидантов в составе липосом показатели гемолиза при концентрациях внешних растворов 0,3 и 0,5 % приближались к значениям, наблюдавшимся для свежевыделенных эритроцитов.
Рис. 1. Доля (%) гемолиза эритроцитов в различных концентрациях NaCl после 24 - часовой инкубации при 37 оС с липосомами, содержащими антиоксиданты. Условные обозначения: Конт. - контрольная группа, без липосом, * - достоверность различий относительно значений в контрольной группе при р<0,05.
Инкубация эритроцитов в физиологическом растворе приводит к истощению запасов АТФ, что на фоне высокого содержания кислорода и снижения антиоксидантной защиты приводит к образованию активных форм кислорода и активации процессов липопероксидации. Включение в инкубационную среду липосом с антиоксидантами - ДГКЛ и ЭМОЛ, в условиях нашего эксперимента позволяло сохранить характеристики мембран эритроцитов близкими к свойствам интактных мембран. Известно, что взаимодействие липосом с мембранами эритроцитов происходит по типу слияния и адгезии [9]. В итоге липиды и липофильные составляющие липосом встраиваются в мембрану эритроцитов. Поэтому можно полагать, что эффект липофильных антиоксидантов - дигидрокверцетина и α-токоферола, проявляется в «гашении» липидных радикалов и молекул активных форм кислорода непосредственно в мембране. Эффект гидрофильного антиоксиданта эмоксипина, по-видимому, реализуется в примембранном пространстве также по механизму инактивации свободных радикалов.
Выводы
- При хранении эритроцитов в изотоническом забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) при температуре 37 °С в течение 24 часов происходит снижение их осмотической резистентности.
- Инкубация эритроцитов в тех же условиях с добавлением липосомальных форм антиоксидантов улучшает сохранность мембран эритроцитов. В условиях нашего эксперимента максимальный мембраностабилизирующий эффект проявляли липосомы, содержащие эмоксипин, и липосомы с дигидрокверцетином.
Рецензенты:
- Журавлева Ирина Юрьевна, д.м.н., профессор, главный научный сотрудник ФБГУ «НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово.
- Лурье Семен Борисович, д.б.н., профессор кафедры физиологии человека и животных ФБГУ «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово.