В настоящее время во всем мире повышается потребность населения в седативных средствах. Эти препараты используют как в лечении пациентов с различными заболеваниями, так и у здоровых людей при стрессовых ситуациях. В нашей стране традиционно популярными являются фитотерапевтические средства, в том числе препараты валерианы лекарственной, пустырника пятилопастного, мяты перечной, синюхи голубой, ландыша майского и другие. Растительные препараты отличает низкая токсичность, возможность длительного применения без существенных побочных эффектов, широкий спектр фармакологической активности, относительно низкая стоимость и простота производства.
Среди растительных препаратов имеются многокомпонентные лекарственные сборы, в том числе, успокоительный сбор №3. Сборы используют в виде водных извлечений. Эта лекарственная форма, наряду с рядом преимуществ, обладает и существенными недостатками, связанными с приготовлением водных извлечений в соответствующем режиме, невозможностью точного дозирования, достаточно быстрой микробной контаминацией и коротким сроком годности. Она не позволяет полностью использовать весь комплекс биологически активных веществ, содержащихся в исходном растительном сырье. Технология переработки растительного сырья должна позволять максимально полно использовать весь комплекс биологически активных веществ, содержащихся в исходном растительном сырье.
Нередко лечебное действие растений связано не с одним веществом, а с их комплексом, содержащимся в растении. Во многих случаях применение биологически активного вещества в чистом виде не дает такого эффекта, который возможно получить при использовании суммарной вытяжки из всего растения, то есть при использовании биологически активного вещества в комплексе с другими элементами [2].
Следует отметить, что некоторые биологически активные вещества, называемые обычно веществами вторичного происхождения, не накапливаются в растении в большом количестве и являются промежуточными продуктами обмена веществ, образуясь в растении, тотчас же используются клеткой для различных синтетических процессов, например, органические кислоты. Часто они играют весьма важную роль в обмене веществ у растений, но некоторые из них обладают специфическим действием на организм и имеют важное лечебное значение. [2].
Весьма актуальным является внедрение в медицинскую практику максимального количества стандартизированных фитофармацевтических средств (в том числе обладающих седативным эффектом) с подтвержденным действием и дозировкой [5]. Анализ данных литературы и опыт практического применения лекарственных форм из растительного сырья свидетельствуют о том, что весьма актуальным является перевод лекарственного растительного сырья, используемого для приготовления настоев и отваров, в сухие водорастворимые экстракты как наиболее перспективную и рациональную форму [1].
Цель настоящего исследования - оценить содержание основных групп биологически активных веществ в водных и водно-спиртовых извлечениях успокоительного сбора № 3.
Материалы и методы. Объектом исследования являлся успокоительный сбор № 3 (ОАО Красногорсклексредства, Россия). В соответствии с инструкцией по медицинскому применению из сбора готовят водное извлечение (настой). Из этого сбора возможно получение и других лекарственных форм, в том числе водно-спиртовых извлечений (настоек) и экстрактов.
Из сбора получали исследуемые образцы:
Образец № 1. Настой, изготовленный в соответствии с инструкцией по медицинскому применению (1:40), - 1 столовую ложку сбора помещали в эмалированную посуду, заливали 200 мл (1 стакан) кипятка, нагревали на кипящей водяной бане 15 минут, охлаждали 45 минут при комнатной температуре, процеживали и доводили объем до 200 мл кипяченой водой.
Образец № 2. Настой, изготовленный в соответствии с требованиями ГФ XI(1:10), - 10,0 г сбора помещали в инфундирку, заливали водой очищенной 100 мл, и настаивали в инфундирном аппарате в течение 15 минут, охлаждали при комнатной температуре 45 минут, процеживали через 4 слоя марли, объем полученного настоя доводили кипяченой водой до 100 мл.
Образец № 3. Экстракт сухой водорастворимый, полученный в лабораторных условиях на базе ОАО «Биохиммаш», с использованием распылительной сушилки. Экстракт сухой успокоительного сбора № 3 перед исследованием растворяли в воде очищенной.
Образец № 4. Настойка, полученная в лабораторных условиях методом перколяции, с применением в качестве экстрагента 70 % спирта этилового.
При изучении качественного состава извлечений были проведены химические фармакопейные реакции на основные группы биологически активных веществ.
Содержание флавоноидов в исследуемых образцах устанавливали цветными реакциями с магниевой стружкой в присутствии кислоты хлористоводородной концентрированной (цианидиновая проба) и с раствором хлорида окисного железа, а также осадочными реакциями с 2 % раствором ацетата свинца и реактивом Фелинга [3].
Дубильные вещества определяли реакциями с раствором железоаммониевых квасцов, с 1 % раствором желатины; полисахариды доказывали реакцией с 95 % этиловым спиртом; наличие сапонинов определяли по реакции пенообразования: в одну пробирку приливали 5 мл 0,1 н. кислоты хлористоводородной, в другую - 5 мл 0,1 н. натрия гидроксида. Затем в обе пробирки добавляли 2-3 капли извлечения и сильно встряхивали. Результат оценивали по стойкости и объему образующейся пены.
Количественное определение биологически активных веществ в полученных извлечениях проводили химическими (титриметрическими, гравиметрическими) методами и спектрофотометрическим методом.
Содержание свободных органических кислот определяли согласно модифицированной методике ГФ ХI: 10 мл извлечения (водного, спиртового) помещали в колбу на 500 мл, прибавляли 300 мл воды очищенной, 1 мл 1% спиртового раствора фенолфталеина, 2 мл 0,1 % метиленового синего и титровали 0,1 моль/л натрия гидроксидом до появления в пене лилово-красной окраски [3].
Содержание свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в процентах вычисляли по формуле (1):
(1)
где, 0,0067 - количество свободных органических кислот в пересчете на яблочную, соответствующее 1 мл раствора гидроксида натрия (0,1 моль/л), в граммах,
V - объем раствора гидроксида натрия (0,1 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах,
K - поправка на титрант.
Для анализа сухого экстракта точную навеску массой 0,5 г растворяли в 50 мл горячей воды, после охлаждения проводили анализ по приведенной выше методике.
Дубильные вещества количественно определяли по методике ГФ ХI в модификации: 25 мл извлечения (водного, спиртового) помещали в колбу вместимостью 1 литр, прибавляли 750 мл воды очищенной, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании 0,1 моль/л раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания [3].
Содержание дубильных веществ, в пересчете на танин, вычисляли по формуле (2):
(2)
где, 0,004157 - количество дубильных веществ, в пересчете на танин, соответствующее 1 мл раствора перманганата калия (0,1 моль/л), в граммах,
V1 - объем раствора перманганата калия (0,1 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах,
V2 - объем раствора перманганата калия (0,1 моль/л), пошедшего на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах,
K - поправка на титрант.
Для анализа сухого экстракта точную навеску массой 0,5 г растворяли в 50 мл горячей воды, после охлаждения проводили анализ по приведенной выше методике.
Количественный анализ флавоноидов в водных, спиртовых извлечениях успокоительного сбора № 3 и сухом экстракте водорастворимом проводили методом, основанным на спектрофотометрировании комплексов флавоноидов с ионами металлов. Регистрацию УФ спектров проводили с помощью спектрофотометра «СФ-56». Количественное содержание флавоноидов в исследуемых образцах определяли в пересчете на рутин [3].
При проведении исследования использовали методику, согласно которой 5 мл препарата помещали в мерную колбу емкостью 25 мл, доводили спиртом 70 % до метки и перемешивали (раствор А). 5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу емкостью 25 мл, прибавляли 5 мл 2 % раствора хлорида алюминия, 0,1 мл уксусной кислоты ледяной, доводили объем раствора спиртом 95 % до метки и перемешивали. Через 30 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 412 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 5 мл раствора А, 0,1 мл кислоты уксусной ледяной, доведенный спиртом 95 % до метки в мерной колбе емкостью 25 мл.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора, состоящего из 1 мл 0,05 % раствора рутина, 5 мл раствора алюминия хлорида, 0,1 мл кислоты уксусной ледяной и доведенного спиртом 95 % до метки в мерной колбе емкостью 25 мл.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл 0,05 % раствора РСО рутина и 0,1 мл кислоты уксусной, доведенный до метки в мерной колбе емкостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин вычисляли по формуле (3):
(3)
где, D - оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны 412 нм,
D0 - оптическая плотность раствора сравнения,
a - объем раствора, взятого на анализ, мл.
Для анализа сухого экстракта использовали аналогичную методику, образец предварительно растворяли в воде очищенной.
Результаты исследования были обработаны статистически с применением стандартного пакета программ «MsExcel' 2003».
Результаты и их обсуждение
Анализ результатов химического исследования показал, что во всех лекарственных формах успокоительного сбора № 3 присутствовали дубильные вещества, полисахариды, флавоноиды, сапонины. Так, было обнаружено, что как водные, так и водно-спиртовые извлечения из сбора давали положительную цианидиновую пробу, образующиеся оксониевые соединения имеют окраску от оранжевого до красно-фиолетового цвета; при взаимодействии флавоноидов с раствором хлорида окисного железа флавонолы (рутин, кверцетин) образуют комплексы, окрашенные в зеленый цвет. При испытании водных и водно-спиртовых извлечений из сбора получено зеленое окрашивание.
Появление черно-синего окрашивания в реакции с раствором железоаммониевых квасцов и помутнение раствора от добавления 1 % раствора желатины во всех извлечениях свидетельствует о наличии дубильных веществ. На содержание полисахаридов указывает появление белого студенистого осадка в реакции с 95 % этиловым спиртом. При проведении реакции пенообразования установлено, что в щелочной среде образуется пена по стойкости и объему в несколько раз больше, чем в кислой среде, что свидетельствует о присутствии стероидных сапонинов.
Следует отметить, что количественное содержание биологически активных веществ в лекарственных формах успокоительного сбора № 3 отличалось (таблица 1).
Таблица 1. Содержание биологически активных веществ в различных лекарственных формах успокоительного сбора № 3
|
№ |
Лекарственная форма успокоительного сбора № 3 |
Содержание действующих веществ, % |
||
|
Флавоноиды |
Дубильные вещества |
Свободные органические кислоты |
||
|
1 |
Настой 1:40 (по инструкции) |
0,008±0,0001 |
0,06±,01#* |
0,21±0,02 |
|
2 |
Настой 1:10 (по ГФ ХI) |
0,018±0,0002 |
0,15±0,02* |
0,21±0,02 |
|
3 |
Водный раствор экстракта сухого |
0,018±0,0002 |
0,24±0,03# |
1,08±0,11*# |
|
4 |
Водно-спиртовое извлечение |
0,06±0,002 |
0,29±0,03# |
0,26±0,03 |
Примечание: * - различия содержания действующих веществ в препаратах сбора с содержанием действующих веществ в настойке достоверны (р<0,05);
# - различия содержания действующих веществ в препаратах сбора с содержанием действующих веществ в настое (изготовленном по ГФ) достоверны (р<0,05).
Установлено, что в водно-спиртовом извлечении из сбора (настойке) содержание флавоноидов составило 0,06±0,002, что в среднем в 3,3 раза (р<0,05) больше, чем в водном растворе экстракта сухого и настое, изготовленном по требованиям ГФ. Однако в наименьшем количестве флавоноиды содержались в настое седативного сбора, а именно 0,008±0,0001, что в среднем в 7,5 раз (р<0,05) меньше, чем в настойке и в 2,3 раза (р<0,05) меньше, чем в растворе экстракта сухого и настое сбора 1:10.
Максимальное содержание дубильных веществ отмечалось в водно-спиртовом извлечении и в водном растворе экстракта сухого исследуемого сбора, наименьшее - в настое, приготовленном в соответствии с инструкцией по медицинскому применению. Следует отметить, что содержание дубильных веществ в настое, изготовленном в соответствии с требованиями ГФ, было в среднем в 2,5 раза (р<0,05) выше, чем в настое, изготовленном в соответствии с инструкцией по медицинскому применению.
Таким образом, на содержание флавоноидови дубильных веществ оказал влияние характер экстрагента и режим экстракции: наибольшее количество извлекается органическими растворителями и путем выщелачивания горячей водой по принципу противотока [4]. Наименьшая насыщенность флавоноидами настоя объясняется их физико-химическими свойствами, агликоны флавоноидов растворимы в спирте и практически не растворимы в воде.
Свободных органических кислот по результатам анализа больше всего было в водном растворе экстракта сухого. В водно-спиртовом извлечении из сбора содержание свободных органических кислот было в среднем в 4,2 раза (р<0,05) меньше, чем в водном растворе экстракта сухого. В наименьшем количестве органические кислоты содержались в настое успокоительного сбора. Причем различий в содержании этих веществ в настое, изготовленном в соответствии с инструкцией по медицинскому применению, и в настое, изготовленном в соответствии с требованиями ГФ, обнаружено не было.
Установлено, что наибольший выход из растительного сырья свободных органических кислот обеспечивается при получении экстракта сухого: экстрагированием трехкратно методом мацерации водой очищенной при температуре 80 °С.
Результаты проведенного экспериментального исследования показали, что наиболее полное извлечение биологически активных веществ из успокоительного сбора № 3 обеспечивается при получении экстракта сухого водорастворимого и водно-спиртового извлечения (настойки).
Основными факторами, влияющими на скорость и полноту экстракции биологически активных веществ из растительного сырья, являются тип экстрагента, температура, измельченность сырья и продолжительность экстракции.
Учитывая фармакологическую неиндифферентность спирта этилового как экстрагента при получении настоек, водорастворимая форма экстракта сухого имеет рядом преимуществ и в сравнении с настоем позволяет получить лекарственную форму, обеспечивающую точное дозирование БАВ.
Выводы
- Качественными химическими реакциями установлено содержание основных биологически активных веществ в водных и водно-спиртовых вытяжках из успокоительного сбора № 3.
- В водно-спиртовом извлечении сборафлавоноидов содержится в среднем в 3,3 раза (р<0,05) больше чем в растворе экстракта сухого и в среднем в 7,5 раз(р<0,05) больше, чем в настое, изготовленном в соответствии с инструкцией по медицинскому применению.
- Содержание дубильных веществ в растворе экстракта сухого седативного сбора № 3 было в 1,6 раз (р<0,05) выше, чем в настое, изготовленном в соответствии с требованиями ГФ и в 4 раза (р<0,05) выше, чем в настое, изготовленном в соответствии с инструкцией по медицинскому применению.
- Содержание свободных органических кислот в растворе экстракта сухого седативного сбора № 3 в среднем в 4,2 раза (р<0,05) и в 5 раз (р<0,05) выше, чем в настойке и настое соответственно.
Рецензенты:
- Демидова Марина Александровна,д.м.н., профессор, заведующая кафедрой управления и экономики фармации Тверской государственной медицинской академии, г. Тверь.
- Зубарева Галина Мефодьевна, д.б.н., профессор, заведующая кафедрой химии и биохимии Тверской государственной медицинской академии, г. Тверь.