Современное дезинфицирующее средство, как правило, представляет собой композицию на основе сбалансированной формулы, включающей одно или несколько активно действующих веществ в соотношениях, позволяющих добиться максимального синергизма или потенцирования эффекта в отношении наиболее устойчивых микроорганизмов, а также функциональных добавок, целенаправленно изменяющих их свойства. Обязательным условием для дезинфицирующего средства, используемого для дезинфекции высокого уровня (ДВУ), является его спороцидное действие, т.е. другими словами, это средства, используемые в той же концентрации, при той же температуре и кратности применения, что и при стерилизации, но при сокращенном времени экспозиции [1, 2, 3].
Цель исследований - изучить спороцидное действие нового полифункционального биоцидного препарата.
Материалы и методы
При проведении исследований использовались методики:
Методические указания о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики; утв. ГУВ МСХ СССР 27.12.87 г.
В исследованиях использовали следующие материалы:
- тест-культуру микроорганизмов: B. subtilis шт. 1с (рВМВ5)
- биоцидную композицию, представляющую собой сбалансированный комплекс, в состав которого входят в качестве действующих веществ различные группы химических соединений, обладающие бактерицидными свойствами, а также поверхностно-активные вещества (ПАВ), в опытах использовались (1; 2; 3; 4 %-ые) концентрации и 30, 60, 90 и 120 минутные экспозиции.
Для исследования спороцидного действия препарата использовали кусочки обезжиренного батиста, размером 0,5-1,0 см, стерилизованного в автоклаве. Нужное для исследования количество стерильного батиста помещали в стерильную чашку Петри и заливали 10- 20 мл 2-х миллиардной бактериальной суспензии.
Тест-культуру, используемую для импрегнации батистовых тест-объектов, предварительно пассажировали (четырехкратно) на соответствующих питательных средах. Импрегнировали бактериальной суспензией не менее 3-х тест-объектов. После внесения тест-объектов (с культурой) в дезинфицирующий раствор и экспозиции (30, 60, 90, 120 мин) проводили промывку «носителей» в стерильной дистиллированной воде. Далее производили посев на питательную среду (МПА), с последующей инкубацией в термостате. В качестве контроля спороцидного действия изучаемого препарата использовали стерильную дистиллированную воду.
Для изучения спороцидного действия биоцидной композиции использовали трансмиссионную электронную микроскопию. Для этого образцы фиксировали в 4 %-ом растворе параформальдегида при +4о С в течение 48 ч. Бактериальную взвесь центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об/мин. Тест-образцы разрезали на две части, которые складывали стопкой. Затем тест-образцы и полученный после центрифугирования осадок дофиксировали 1 %-ным раствором осмиевой кислоты, обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия). Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония), фотосъемку проводили с помощью встроенной цифровой камеры Jeol и цифровой камеры бокового ввода Veleta (SIS, Германия).
Результаты исследований и их обсуждение
Спороцидное действие биоцидного препарата отмечено в 4 %-ой концентрации и 90 минутной экспозиции (таблица).
Таблица. Спороцидное действие биоцидной композиции
|
Микроорганизмы |
Концентрация препарата в % |
Экспозиция в (мин) |
|||
|
30 |
60 |
90 |
120 |
||
|
Bacillus subtilis шт. 1с (рВМВ5) |
1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
2 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
4 |
+ |
+ |
- |
- |
|
|
Контроль Н2О |
+ |
||||
Примечание: «+» - четкий рост; «-» - нет роста
При изучении электронограмм в контроле B. subtillis шт. 1 с (рВМВ5) морфологический анализ определил нормальную морфологию микробной клетки. Сохранены и отчетливо выявляются поверхностные мембраны клеток, нуклеоиды, зернистое содержимое цитоплазмы (рисунок 1).
Рисунок 1. B. subtilis. Контроль.
Нормальная морфология бактериальной клетки
После 90 минутного воздействия 4 % рабочего раствора препарата на субмикроскопическую структуру B. subtillis микробные клетки находятся на разной стадии лизирования. Спороплазма клеток набухшая, зона кортекса оттеснена на периферию, наблюдается повышенная электронно-оптическая плотность, повреждаются экзоспориум и споровые оболочки. Наблюдается фрагментация цитоплазматической мембраны и клеточной оболочки, деструкция цитоплазмы и нуклеоида (рисунок 2), после воздействия 4 %-ого рабочего раствора препарата и экспозиции 120 минут наблюдается массовый лизис споровых клеток (рисунок 3).
Рисунок 2. B. subtilis лизис микробных клеток, разрывы цитоплазматической мембраны
Рисунок 3. B. subtilis массовый лизис микробных клеток
Основным первичным механизмом повреждения споровых клеток после применения нового биоцидного препарата является деструкция клеточной мембраны, которая проявляется фрагментацией и разрывом цитоплазматической мембраны, следующие за этим вторичные повреждения: разрушение цитоплазмы и нуклеоида способствуют деструктивно- дистрофическим изменениям в кортексе и сердцевине споровых клеток, что приводит к дальнейшей гибели (лизису) микробных клеток.
Выводы
- Новый полифункциональный биоцидный препарат обладает спороцидным действием в 4 %-ой концентрации и 90 минутной экспозиции.
- Основой механизма биоцидного действия препарата в отношении споровых форм является мембраноатакующее действие.
Рецензенты:
- Плешакова Валентина Ивановна, доктор ветеринарных наук, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П. А. Столыпина, г. Омск.
- Бажин Михаил Аристоклевич, доктор ветеринарных наук, профессор Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных, г. Омск.