Изучение закономерностей гистогенеза сухожилий мышц конечности, удлиняемой методом чрескостного дистракционного остеосинтеза, представляет интерес как для ортопедической практики (успех коррекции укорочений конечности зависит от состояния ее мышечно-сухожильного комплекса [1]), так и в теоретическом аспекте (исследования, посвященные морфогенезу соединительной ткани сухожилий, в данных условиях, несмотря на многолетний научный опыт, единичны и требуют дальнейшего изучения).
В отдельных публикациях ткань сухожилия рассматривают как высокоупорядоченный макромолекулярный композитный материал, состоящий в основном из коллагеновых волокон, погруженных в желеподобную матрицу из кислых мукополисахаридов [3]. Такая структура обеспечивает сухожилию высокие прочностные и эластические свойства [7]. Биомеханические свойства сухожилия формируют коллагеновые и эластические волокна, протеогликаны и гликопротеины, особенности цитоархитектоники клеток [6; 9]. Основную роль при этом играют коллагеновые волокна. Важное значение в формировании ткани сухожилия имеют сульфатированные гликозаминогликаны и протеогликановые комплексы. Протеогликановые мостики связывают друг с другом коллагеновые фибриллы, обеспечивая их лабильность и взаимостабилизацию [5]. Соединительная ткань, и в частности ее внеклеточный матрикс, - сложнейшая многокомпонентная система. Высокая степень организованности и упорядоченности ее межклеточного матрикса выражается специфическими количественными соотношениями образующих его биополимеров. Любые отклонения от этих специфических соотношений не могут не повлечь за собой нарушений структуры и функций соединительной ткани [4].
Ахиллово сухожилие играет важную роль в организации локомоторной функции конечности (ходьбе, беге, прыжках). Знание особенностей гистоструктурных изменений, происходящих в данном сухожилии на каждом из этапов чрескостного дистракционного остеосинтеза, очень важно для общей оценки функционального состояния конечности.
Цель настоящего исследования - провести комплексную оценку гистохимических процессов, объясняющих механизмы гистогенеза ахиллова сухожилия в разные периоды чрескостного дистракционного остеосинтеза по Г.А. Илизарову.
Материалы и методы исследования. Материалом исследования послужило ахиллово сухожилие 14 взрослых (1-3 года) беспородных собак, которым осуществляли флексионную остеоклазию берцовых костей и через 5 суток после операции начинали удлинение голени путем осуществления ручных подкруток гаек по стержням (суточный темп удлинения - 1 мм за 4 приема) (эксперименты выполнены совместно с к.в.н. А.А. Емановым). Величина удлинения голени составляла 17,6±0,4%. Животных выводили из опыта через 28 суток дистракции, 30 суток фиксации, 30 суток после снятия аппарата. Уход, оперативные вмешательства, эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». В качестве контроля исследовали ахиллово сухожилие 6 интактных собак.
Часть материала фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Сульфатированные гликозаминогликаны (ГАГ) на гистологических срезах ахиллова сухожилия выявляли окрашиванием их альциановым синим с рН 1,0, несульфатированные ГАГ - с рН 2,5. Постановкой ШИК-реакции выявляли гликопротеины. Для подтверждения специфичности выбранных методик параллельно проводили предварительное воздействие на контрольные срезы тестикулярной гиалуронидазой (для расщепления гликозаминогликанов в первом случае) и амилазой слюны (для расщепления гликогена при использовании ШИК-реакции). Для выявления суммарного белка срезы окрашивали бромфеноловым синим.
Другую часть фрагментов сухожилия фиксировали в смеси альдегидных фиксаторов, дегидратировали и заливали в аралдит. Поверхность блоков выравнивали стеклянными ножами, напыляли тонким слоем серебра или платины в вакуумном напылителе «JEE- 4 Х/5 В» и ионном напылителе IB-6 для создания электро- и теплопроводности. При помощи рентгеновского электронно-зондового микроанализатора «INСA Energy 200», смонтированного на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840», определяли распределение и концентрацию серы (маркера сульфатированных ГАГ) в ахилловом сухожилии в различные периоды чрескостного дистракционного остеосинтеза, после чего поверхность блоков протравливали 5-10%-ным раствором этиолята Na и исследовали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840».
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики, применяемым для малых выборок, с принятием вероятности р, равной 0,05. Для оценки достоверности различий полученных результатов использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, для чего применяли программы: Microsoft Excel, версия 5.0 и программу АtteStat, разработанную в информационно-вычислительном центре ФГУН РНЦ «ВТО» им. акад. Илизарова Росздрава И.П. Гайдышевым.
Результаты исследования и их обсуждение. Полученные результаты показали, что при окрашивании ахиллова сухожилия интактных животных альциановым синим как при рН 1,0, так и при рН 2,5 наибольшее проявление альцианофилии наблюдалось в областях пери- и эпитендиния, а также в оболочках сосудов микроциркуляторного русла. Собственно сухожильные пучки проявляли слабую, едва различимую альцианофильную реакцию. На поперечных гистологических срезах выявляли окрашивание сухожильных клеток.
Рис. 1. Проявление альцианофилии в ахилловом сухожилии в различные периоды эксперимента: а, г - через 28 суток дистракции; б, д - через 30 суток фиксации; в, е - через 30 суток после снятия аппарата. Препараты окрашены альциановым синим (верхний ряд -при рН 1,0, нижний - при рН 2,5). Увеличение - 160х.
Через 28 суток дистракции отмечали усиление окраски как собственно сухожильных пучков, особенно в наружных участках, прилегающих к пучковым оболочкам, представленных рыхлой волокнистой соединительной тканью, так и самих сухожильных оболочек. Альцианофильная окраска была более выражена при рН 1,0 (рис. 1 а, г). В последующие периоды эксперимента мы наблюдали усиление альцианофилии всех структур, что свидетельствовало о накоплении в тканях сухожилия сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов (рис. 1 б, в, д, е).
Таблица 1 - Динамика содержания серы в тканях ахиллова сухожилия в различные периоды чрескостного дистракционного остеосинтеза
|
Этапы эксперимента |
Содержание S (вес. %) |
|||
|
Интактные животные |
Дистракция 28 суток |
Фиксация 30 суток |
Без аппарата 30 суток |
|
|
Среднее |
0,43 |
0,63** |
0,76*∙∙ |
2,8*∙
|
|
Ошибка среднего |
0,16 |
0,12 |
0,06 |
0,63 |
* - при р ≤ 0,01;
** - при р ≤ 0,05 (по сравнению с контролем);
∙ - при р ≤ 0,01;
∙∙ - при р ≤ 0,05 (по сравнению с предыдущим периодом).
Полученные данные подтверждали результаты рентгеновского электронно-зондового микроанализа (таблица 1), свидетельствующие о пролонгированном накоплении в тканях ахиллова сухожилия сульфатированных гликозаминогликанов.
Результаты рентгеновского электронно-зондового анализа показали постепенное накопление серы в ахилловом сухожилии. Если условно ее содержание в сухожилии интактных животных принять равной 100%, то по окончании периода дистракции содержание серы было увеличено в среднем на 46,5% (р≤0,05), по окончании периода фиксации конечности в аппарате - на 76,7% (р≤0,01), что на 30,2% больше, чем в предыдущий период (р≤0,05). Через месяц после снятия аппарата содержание серы увеличивалось по сравнению с показателями интактных животных в 6,5 раза (р≤0,01), что в 3,68 раза было больше, чем в период фиксации конечности аппаратом (р≤0,01). Полученные количественные данные согласовывались с распределением серы на картах электронно-зондового микроанализа ахиллова сухожилия в характеристическом излучении данного химического элемента (рис. 2).
a
б 
в 
г 
д 
Рис. 2. Электронные изображения поперечно ориентированного фрагмента ахиллова сухожилия: а - электронная сканограмма ахиллова сухожилия; карты электронно-зондового микроанализа ахиллова сухожилия в характеристическом излучении серы; б - сухожилие интактной собаки; в - через 28 суток удлинения голени по Илизарову; г - через 30 суток фиксации конечности в аппарате; д - через 1 месяц после снятия аппарата. Увеличение - 25х.
При анализе гистологических препаратов интактных животных, окрашенных бромфеноловым синим, выявили, что наибольшая интенсивность окрашивания соответствовала собственно сухожильной ткани пучков, а также пери- и эпитендинию в области, прилежащей непосредственно к пучкам. Их наружные участки были окрашены слабее. Усиленное окрашивание, соответствующее накоплению белковых компонентов, было характерно для стенок сосудов. Через 28 суток дистракции отмечали усиление бромфенолового окрашивания эндо-, пери- и эпитендиния ахиллова сухожилия. Интенсивность окраски пучков визуально не изменялась. Через 30 суток фиксации данные изменения выявлялись в большей степени. Через 30 суток после снятия аппарата отмечали усиление интенсивности окрашивания как в области сухожильных пучков, так и в области их оболочек, состоящих из рыхлой волокнистой соединительной ткани.
а 
б 
в 
Рис. 3. Выраженность фибриллогенеза в различные периоды эксперимента: а - через 28 суток дистракции; б - через 30 суток фиксации конечности в аппарате; в - через 30 суток после снятия аппарата. Электронные сканограммы. Увеличение: а - 3000х; б, в - 1500х.
Полученные данные свидетельствовали о том, что выраженность процесса фибриллогенеза в ахилловом сухожилии определялась уже в период дистракции и усиливалась в постдистракционный период, что мы связываем с новообразованием волокнистых структур, перестройкой фибриллярного остова сухожилия в ответ на микроповреждения отдельных коллагеновых волокон, биодеградация которых являлась естественным стимулятором биосинтетических процессов [2]. Полученные гистохимические данные соответствовали картинам фибриллогенеза, полученным методом сканирующей электронной микроскопии в различные периоды эксперимента, также подтверждающим компенсаторное усиление процесса фибриллогенеза в постдистракционный период (рис. 3).
При постановке ШИК-реакции у интактных животных отмечалось интенсивное окрашивание сухожильных пучков. Окружающие их прослойки рыхлой волокнистой соединительной ткани имели менее интенсивную окраску. В пучках содержание ШИК-положительных веществ (гликопротеинов) усиливалось от центра к периферии. Оболочки сосудов эпи- и перитендиния окрашивались с достаточной интенсивностью. Через 28 суток дистракции проявление ШИК-реакции в эпи- и перитендинии незначительно увеличивалась. Через 30 суток фиксации незначительно усиливалась окраска как пучков, так и рыхлой волокнистой соединительной ткани эпи- и перитендиния.
Через 1 месяц после снятия аппарата области повреждения сухожильных волокон не визуализировались, окраска пучков соответствовала таковой у интактных животных, оболочки сохраняли более высокую интенсивность окрашивания. В слое эпитендиния, непосредственно окружающего сухожильную ткань, проявление ШИК-реакции было интенсивнее, чем в наружных участках.
Результаты исследований, полученных гистохимическими методами, методами сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского электронно-зондового микроанализа, показали постепенное усиление коллагенообразования на всех сроках эксперимента, что является следствием репаративного процесса, направленного на восстановление коллагенового каркаса. Выявленная в данном исследовании динамика содержания ШИК-позитивных компонентов в тканях ахиллова сухожилия связана с формированием фибриллярного матрикса. По теории L. Robert и R. Robert [10], сиалогликопротеины являются матрицей для ориентированного отложения коллагена, эластина и базальных мембран. Известно, что многие гликопротеины связаны с протеогликанами и являются посредниками в агрегации последних с коллагеновыми фибриллами [8].
Выявленное неравномерное распределение ГАГ в тканях ахиллова сухожилия: усиление альцианофилии в оболочках, незначительное ослабление окраски в центральной части пучков связано с перерастяжением волокнистых структур и репаративными процессами, вызванными частичной деструкцией отдельных коллагеновых волокон.
Период окончания фиксации, очевидно, являлся критическим по напряженности адаптационных процессов во внеклеточном матриксе и подтверждающим активное накопление сульфатированных гликозаминогликанов. После снятия аппарата преобладало накопление несульфатированных ГАГ, превосходящее таковое у интактных животных, что свидетельствовало об обратимом характере изменений, наблюдаемых в предыдущие периоды эксперимента.
Таким образом, полученные результаты показали, что удлинение голени методом чрескостного дистракционного остеосинтеза на 17,6% в данном эксперименте не приводит к срыву механизмов гомеостатической саморегуляции и необратимым деформациям тканей ахиллова сухожилия. Пик биосинтетической активности и накопление компонентов, формирующих внеклеточный матрикс ахиллова сухожилия, приходится на постдистракционный период.
Рецензенты
Ирьянов Ю.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории морфологии. ФГБУ «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Курган.
Стогов М.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник клинико-экспериментального лабораторного отдела. ФГБУ «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Курган.