Высшие водные растения обладают высокой аккумулятивной способностью и используются для определения антропогенных химических нагрузок на водоем в системе биомониторинга состояния окружающей среды [2, 7; 8].
Поскольку под действием антропогенного загрязнения окружающей среды в растениях-биоиндикаторах могут происходить изменения на химическом и анатомическом уровнях, то эффективными методами изучения этих изменений являются Фурье-ИК-спектроскопия, РЭМ и РМА. Точная идентификация типов образуемых соединений в результате накопления растением разных поллютантов позволяет с успехом использовать метод ИК-спектроскопии в биомониторинге кислотного загрязнения [1; 2; 7]. Сочетание РМА и РЭМ позволяет определять элементный состав в объеме ~ 1 мкм3 посредством регистрации рентгеновского излучения. Энергия фотонов, попадающих в детектор, преобразуется в электрический сигнал, который формирует спектр рентгеновского излучения, где каждому химическому элементу соответствует определенный набор пиков, позволяющий идентифицировать элементный состав с проведением количественного анализа [10].
Цель работы - изучение влияния поллютантов на химический состав и анатомическую структуру листа роголистника темно-зеленого методами ИК-спектроскопии, РЭМ и РМА.
Материалы и методы исследования
Объект исследования - Ceratophyllum demersum L. (Роголистник темно-зеленый). Исследуемый вид (гидрофит) встречается в Тверском регионе в стоячих, медленно текущих водах и способен произрастать как в чистых, так и загрязненных местах обитания [7]. Сбор растений и забор воды на химический анализ производился в водоемах на территории Тверской обл., которые делили по фактору близости к источнику загрязнения на две группы - фоновый и загрязненные (табл. 1).
Таблица 1 - Места сбора C. demersum |
||||
№ |
Водоемы |
Экологический статус / Источник загрязнения [8] |
Основные поллютанты [8] |
|
I |
Р. Межа, дер. Большое Федоровское, Нелидовский р-н Тверской обл. |
ООПТ* (фоновый участок), Центрально-лесной государственный природный биосферный заповедник |
- |
|
II |
Озеро-охладитель Удомля, г. Удомля Тверской обл. |
Узлы экологической напряженности |
Калининская АЭС |
Нефтепродукты, малые дозы радиации |
III |
Сточный канал, п. Редкино Конаковского р-на Тверской обл. |
ОАО «Редкинский опытный завод» |
Нефтепродукты, неорганические анионы, аммиак, ароматические соединения, АПАВ** |
|
*ООПТ - Особо охраняемая природная территория. **АПАВ - анионные поверхностно-активные вещества. |
Для последующей интерпретации результатов элементного состава и ИК-спектров образцов растений параллельно был проведен химический анализ воды исследуемых водоемов произрастания C. demersum. Анализ проб воды осуществлялся с помощью спектрофлуориметра «Флюорат-02-панорама» и системы капиллярного электрофореза «Капель-105» фирмы «Люмэкс». Определение неорганических анионов, анионных поверхностно-активных веществ, нефтепродуктов, фенолов в воде проводилось в соответствии с методиками [3-6].
Для записи ИК-спектров исследуемых образцов использовалась методика с KBr [9]. Спектры регистрировали на Фурье-ИК-спектрометре Equinox 55 фирмы Bruker в диапазоне 400-4000 см-1.
Образцы высушенных растений (30-40 °С), зафиксированных на углеродном скотче, исследовали при увеличении в 500 и 1000 раз в режиме высокого вакуума на растровом электронном микроскопе JEOL 6610LV; РМА проводился с помощью системы микроанализа INCA Energy SEM (OXFORD INSTRUMENTS).
Результаты исследования и их обсуждение
Химический анализ воды в исследуемых водоемах
Результаты химического анализа воды из указанных в табл. 1 водоемов показали наличие в ней поллютантов (табл. 2).
Таблица 2 - Химический анализ проб воды исследуемых водоемов |
|||
Показатель, мг/л |
Проба |
||
I (фон) |
II |
III |
|
CL- |
1.2 |
6.2 |
64.0 |
NO2- |
<0.2 |
0.88 |
5.0 |
SO42- |
2.8 |
7.4 |
42.3 |
NO3- |
<0.2 |
1.2 |
<0.2 |
PO43- |
<0.2 |
<0.2 |
<0.2 |
Нефтепродукты |
0.17 |
- |
0.16 |
Фенолы (общее) |
0.001 |
- |
0.38 |
АПАВ |
0.11 |
- |
0.09 |
Данные по основным показателям анализа воды (CL-, NO2-, NO3-, SO42-, фенолы, АПАВ) в пробах II, III значительно превышают фоновые значения (I).
В пробе воды III содержание примесей фенолов, неорганических анионов в несколько десятков раз выше данных показателей пробы I, что свидетельствует о сбросах химического производства ОАО «Редкинский опытный завод» (табл. 2).
Наличие различных поллютантов в водоемах необходимо учитывать в мониторинге, поскольку водные растения способны накапливать вещества-загрязнители (табл. 2) [1; 2; 7].
ИК-спектральный анализ образцов C. demersum
На рис. 1 представлены ИК-спектры образцов C. demersum из различных водоемов. ИК-спектральный анализ показал, что все исследуемые виды имеют полосы поглощения, соответствующие основному химическому составу растения: углеводам ~56% (от абсолютного сухого веса), белкам ~18%, жирам ~1% [7].
Рис. 1. ИК-спектры образцов C. demersum: I и II (а, б); I и III (в, г).
О присутствии углеводов в растении свидетельствуют полосы поглощения, обусловленные валентным колебанием CH2 -групп на частоте ~2925 см-1 и OH-групп на частотах ~3400 см-1 [2; 9]. О наличии белков свидетельствуют полосы поглощения на частотах ~1640 см-1 (Амид I), ~1535 (Амид II), ~1235 (Амид III) [2; 9]. О присутствии жиров можно судить по наличию полос поглощения на частотах ~1735 (nС=О), ~1446 (dСН2-) (табл. 3) [9].
При сравнении ИК-спектров образцов C. demersum из фонового и загрязненных водоемов отмечено значительное изменение химического состава растений. Причем наиболее существенные изменения в интенсивности полос поглощения обнаружены в образцах, собранных в зоне промышленного загрязнения. В образцах из водоемов, не подверженных прямому загрязнению, интенсивность полос находится на уровне фоновых значений.
Спектры образцов растений из загрязненных местообитаний (рис. 1) демонстрируют существенные изменения на частотах: ~2514 см-1 (III), обусловленные валентными колебаниями S-H групп; ~1794 см-1 - валентными колебаниями C=O групп (III); ~876 см-1 - валентными симметричными колебаниями S-O-C группы (III) и ~712 см-1 - валентными колебаниями C-S-C групп (III) (табл. 3) [2; 9]. Полоса поглощения ~1431 см-1, характеризующаяся νаs(SО2), δ(N-H), проявляется во всех спектрах образцов из загрязненных зон, однако наиболее интенсивна в спектре образца III, что связано с высоким содержанием в водной среде серосодержащих анионов, поглощаемых растением (рис. 1), (табл. 3).
Таблица 3 - Отнесение полос поглощения в ИК-спектрах образцов C. demersum |
||||
Положение полосы, см-1 |
Отнесения |
Источник |
||
I |
II |
III |
||
3350 |
3393 |
3423 |
ν(OH) |
[2; 9] |
2926 |
2925 |
2925 |
νаs(CH2) |
[2; 9] |
2855 |
2855 |
2854 |
νs(CH3) |
|
- |
- |
2514 |
ν(S-H) |
[9] |
- |
- |
1795 |
ν(C=O) |
[9] |
1733 |
1738 |
1735 |
ν(С=О) |
[2; 9] |
1653 |
1653 |
1637 |
Амид I ν(C=O) |
[2; 9] |
1533 |
1542 |
- |
Амид II ν(О-C-N) |
[2; 9] |
- |
1438 |
1431 |
νаs(SО2), δ(N-H) |
[9] |
1385 |
1385 |
- |
δ(OH) |
[9] |
1325 |
1325 |
1325 |
δ(CH2) |
[9] |
1233 |
1230 |
1265 |
Амид III δ(N-H) |
[2; 9] |
1201 |
1202 |
1204 |
ν (С-О), δ(OH) |
[9] |
1098 |
1153 |
1101 |
ν (С-О), νаs(СОС) |
[2] |
1071 |
1078 |
1077 |
νаs(СОС) |
[9] |
- |
- |
1052 |
νаs(СОС) |
|
- |
- |
1025 |
ν(OH) |
|
874 |
874 |
876 |
S-O-C |
[2; 9] |
- |
- |
712 |
ν (C-S-C) |
[9] |
Сравнительный анализ C. demersum из разных местообитаний позволяет предположить, что рост интенсивности выше указанных полос поглощения в образцах, взятых из загрязненных водоемов, может быть связан с аккумуляцией и усвоением химических соединений, не свойственных растению, содержащих тиольные, углерод- и азотсодержащие группы [2; 9].
Изучение образцов растений-гидрофитов с помощью РМА и РЭМ
Микрофотографии и рентгеновские спектры образцов растений C. demersum, исследованные методом РЭМ и РМА, представлены на рис. 2.
Рис. 2. Электронные изображения и рентгеновские спектры образцов листьев С. demersum I, II, III.
Как видно из приведенных микроизображений, в образцах растений C. demersum, собранных в загрязнённой зоне, наблюдается деформация и разрушение клеток эпидермиса (образец III), вследствие чего эпидермальный клеточный слой частично теряет свою целостность [10].
В образце II (оз. Удомля) обращает на себя внимание высокая плотность расположенных на эпидермальном слое исследуемого растения-гидрофита диатомовых водорослей (Diatomea sp.). Такое обрастание листьев роголистника водорослями, по-видимому, обусловлено благоприятными для их жизнедеятельности условиями, связанными с повышенным тепловым режимом оз. Удомля Калининской АЭС [1; 10].
Методом РМА определен элементный состав и проведен количественный химический анализ в образцах растений C. demersum (рис. 2). Ниже (табл. 4) приводятся результаты исследований по элементному составу и наличию в тканях C. demersum различных химических элементов из некоторых водоемов Тверской области.
Таблица 4 - Элементный химический состав C. demersum |
|||||||||||||||
Образец |
Химический элемент |
С |
O |
Na |
Mg |
Al |
P |
S |
Cl |
K |
Ca |
Si |
Mn |
Fe |
Итого |
I |
Вес,% |
56.35 |
40.90 |
0.61 |
0.27 |
0.18 |
0.41 |
0.11 |
0.41 |
0.67 |
0.12 |
- |
- |
- |
100 |
II |
48.34 |
45.31 |
0.34 |
0.68 |
0.11 |
0.12 |
0.23 |
0.50 |
0.75 |
- |
3.48 |
0.07 |
0.06 |
100 |
|
III |
53.44 |
41.92 |
1.93 |
0.27 |
- |
0.05 |
0.14 |
1.25 |
0.25 |
0.26 |
0.09 |
0.26 |
0.11 |
100 |
Данные РМА отражают общий химический состав C. demersum [6]. Однако в образцах II и III содержание марганца, железа, серы, хлора выше, чем в фоновом образце, что согласуется с результатами химического анализа воды изучаемых водоемов (табл. 2). Кроме того, в образце II отмечено высокое содержание кремния (рис. 2). Очевидно, источником кремния служит содержащий кремнезем «панцирь» обнаруженных на листьях роголистника диатомовых водорослей [1; 10].
Выводы
С помощью метода Фурье-ИК-спектроскопии удалось доказать способность высших водных растений активно реагировать на изменение химического состава воды ростом интенсивности полос поглощения, связанных с загрязняющими веществами. Материалы исследования позволяют рекомендовать метод Фурье-ИК к использованию в целях эффективного биомониторинга загрязненных водных объектов. При использовании метода РЭМ в биомониторинге на примере C. demersum растений отмечены анатомические изменения в листовых пластинках, наблюдаются деформация и разрушение клеток эпидермиса, что свидетельствует о высокой аккумулятивной и адаптационной способности водных растений. Методом РМА определен элементный состав изучаемых растений, в образцах из мест с антропогенным загрязнением обнаружены тяжелые металлы.
Используемые в работе физические методы анализа могут быть эффективно использованы в биомониторинге окружающей среды.
Авторы выражают благодарность Центру коллективного пользования Тверского государственного университета за помощь в проведении экспериментальных исследований, связанных с растровой электронной микроскопией. Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК № 14.740.11.1281 и при поддержке гранта Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник Молодежного Научно-инновационного Конкурса» («У.М.Н.И.К.»), ГК № 8754р /14008.
Рецензенты:
- Миняев В.И., профессор, д.б.н., зав. кафедрой анатомии и физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет», г. Тверь.
- Зиновьев А.В., профессор, д.б.н., профессор кафедры зоологии ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет», г. Тверь.