Введение

В настоящее время серьезной проблемой медицинского сообщества является растущее число патогенов с резистентностью к антибактериальным препаратам, что значимо ухудшает прогноз исхода заболевания, удлиняет сроки лечения и увеличивает расходы системы здравоохранения [1]. Из-за широкой распространенности и значительного набора факторов вирулентности стафилококки часто вызывают инфекции различных локализаций - от поражения поверхностных слоев кожи до опасных для жизни системных заболеваний [2]. В травматологии и ортопедии стафилококки занимают лидирующую позицию среди основных возбудителей инфекции [3]. По данным 12-летнего ретроспективного наблюдения (с 2011 по 2022 г.), на первом месте по частоте выделения оставался S.aureus – 31,3% [3].

В настоящее время регистрируют рост числа патогенов с множественной лекарственной устойчивостью, в частности MRSA. Резистентность к антибактериальным препаратам различных классов ограничивает терапевтические возможности в лечении инфекций, вызванных устойчивыми патогенами [4].

Ванкомицин, даптомицин и линезолид представляют собой препараты выбора для лечения инфекций, вызванных MRSA, но даже они теряют свою эффективность из-за приобретаемой резистентности у штаммов S.aureus [5]. Устойчивость стафилококков регистрируют и к новым бета-лактамным антибактериальным препаратам, к примеру к цефтаролину – антибиотику 5-го поколения из группы цефалоспоринов [6; 7].

Разработка новых антибактериальных препаратов, активных в отношении стафилококков, устойчивых к ранее используемым средствам, требует огромных материальных и временных затрат. В связи с этим другим путем решения проблемы может быть поиск эффективных комбинаций уже известных антистафилококковых агентов, потенциально обладающих синергидным действием в отношении резистентных S.aureus.

Известно, что лизостафин эффективен против активно растущих бактериальных клеток стафилококков, а также клеток со сниженной метаболической активностью в составе микробных биопленок [8]. Zn-зависимая эндопептидаза продуцируется одним из видов стафилококков ­– Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Лизостафин состоит из домена связывания с клеточной стенкой, который обеспечивает прикрепление фермента, и каталитического домена, который расщепляет сшивающий пентаглициновый мостик в пептидогликане стафилококков. Гидролиз глицин-пептидных связей в клеточной стенке приводит к быстрому лизису бактерий посредством осмотического стресса [9]. Ранее нами было показано активное антистафилококковое действие лизостафина [10–12], однако данное вещество требует дорогостоящей процедуры получения и очистки, поэтому весьма перспективным является изучение лизостафина в качестве потенциального адъюванта при включении в классические схемы антибиотикотерапии ортопедических инфекций.

Цель исследования – оценка влияния субингибирующих концентраций лизостафина на чувствительность штаммов метициллин-резистентных S.aureus (MRSA) к бета-лактамным антибиотикам.

Материалы и методы исследования

Лизостафин получали генно-инженерным способом, и для этого была создана плазмидная ДНК на основе вектора pET39b, содержащая ген лизостафина GenBank: AAB53783.1. Последовательность гена оптимизировали для экспрессии в клетках E.coli с учетом частоты встречаемости кодонов. Полученной плазмидной ДНК pET39b/Lss трансформировали клетки E.coli BL21(DE3) и из полученных трансформантов готовили главный и рабочий банки клеток. Штамм-продуцент выращивали в биореакторе (BTC, Латвия) на полусинтетической питательной среде (общий объем 5л) глубинным способом. Добавление в среду лактозы обеспечивало индукцию синтеза целевого белка. Культивирование продолжали до достижения стационарной фазы роста. Полученную биомассу бактериальных клеток центрифугировали на Sorvall Evolution RC (Thermo Scientific) для разделения с культуральной жидкостью при 15 000 × g, 4 °C в течение 10 минут.

Биомассу суспендировали в буфере 50 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, рН 8.0 при 4 °С в соотношении 1:7. Затем суспензию бактериальных клеток дважды пропускали через проточный гомогенизатор высокого давления APV1000 (SPX, Danmark) при 750 бар. Дебрис удаляли на большегрузной центрифуге Sorvall Evolution RC (Thermo Scientific) при 15000 g, 4 °С, 30 мин. Полученный супернатант передавали на этап выделения и очистки.

Очистку белка проводили на SP-сефарозе (GE, Sweden) в ацетатном буфере в градиенте NaCl 0-1 М на хроматографе AKTA Purifier 100 FPLC System (GE, Sweden). Целевые фракции осаждали сульфатом аммония до насыщения 40%. Суспензию центрифугировали при 9000 g, 4 °С, 10 мин. на центрифуге Eppendorf 5810R. Полученный осадок растворяли в буфере 20 мМ NaOAc, 100 мМ NaCl, рН 5.0 и наносили на колонку с Superdex 75 (GE, Sweden), уравновешенную тем же буфером. Целевые фракции фильтровали через стерилизующие фильтры Millex-GV 0,22 мкм (Millipore), фасовали по 1 мл во флаконы типа 2R и лиофилизировали в сушке AdVantage (VirTis, США).

В готовом продукте определяли чистоту методом электрофореза в ПААГ по Лэмли, содержание бактериальных эндотоксинов методом ЛАЛ-теста и содержание иммунореактивных белков штамма-продуцента при помощи набора F410 (Cygnus, США).

В исследование были включены референсный штамм S.aureus АТСС 43300 (MRSA) и клинические изоляты MRSA: 4710, 7099, 7590, 5085, 3871, выделенные от пациентов с ортопедической инфекцией проспективно в 2025 г. Идентификацию выделенных культур выполняли методом MALDI-TOF масс-спектрометрии с использованием системы FlexControl, Score ≥2,0. Чувствительность стафилококков к различным антибактериальным препаратам изучали в соответствии с EUCAST v.15. Номер штамма соответствует его идентификационному номеру в системе ЛИС «Акросс-Инжири».

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) лизостафина в отношении стафилококков изучали методом серийных разведений от 0,015 до 16 мг/л в бульоне Мюллера - Хинтон (МХБ). Положительным контролем служил ванкомицин, который вносили в лунки планшета вместо лизостафина в концентрациях 0,015–16 мг/л.

Взаимодействие лизостафина и антибактериального препарата изучали методом «шахматной доски». В лунки плоскодонного 96-луночного планшета вносили 100 мкл МХБ, содержащего от 0,015 до 16 мг/л лизостафина и 100 мкл МХБ с антибиотиком (цефазолин, меропенем) в концентрации от 0,05 до 512 мг/л. Затем вносили 20 мкл бактериальной взвеси стафилококков с оптической плотностью 0,5 по шкале Макфарланда. Положительный контроль – 200 мкл МХБ и 20 мкл взвеси бактерий. Планшет инкубировали в течение суток при 37 °C, затем выполняли учет полученных результатов. Все исследования проводили в дубликатах.

Полученные данные были проанализированы и построены графики в программе GraphPad Prism 9.0 (США).

Результаты исследования и их обсуждение

Все штаммы были чувствительны к лизостафину в диапазоне МИК 0,06 до 0,25 мг/л (табл.).

Чувствительность клинических штаммов MRSA к лизостафину

Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

В дальнейших экспериментах тестировали влияние только субингибирующих концентраций лизостафина на восприимчивость штаммов MRSA к бета-лактамным препаратам.

Все включенные в исследование штаммы характеризовались устойчивостью к цефазолину и меропенему. Диапазон МИК цефазолина варьировал от 8 до 512 мг/л, меропенема – от 2 до 128 мг/л. Полученные результаты показали многократное снижение МИК антибиотиков в отношении резистентных S.aureus, что указывает на повышение восприимчивости штаммов к тестируемым антибактериальным препаратам (рис. 1).

Рис. 1. Графическое изображение взаимодействия цефазолина и субингибирующих концентраций лизостафина в отношении эталонного и клинических штаммов MRSА. Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Регистрировали снижение МИК цефазолина в отношении всех тестируемых штаммов в 2–8 раз. Также определяли снижение МИК меропенема в 4–8 раз (рис. 2).

Рис. 2. Графическое изображение взаимодействия меропенема и субингибирующих концентраций лизостафина в отношении эталонного и клинических штаммов MRSА. Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования

MRSA-инфекции трудно поддаются лечению и могут приводить к повышению смертности и увеличению продолжительности пребывания пациента в стационаре [13]. Одним из способов преодоления резистентности стафилококков к бета-лактамным препаратам является применение в одном препарате комбинации антибиотика с одним из ингибиторов бета-лактамаз: клавулановой кислотой, сульбактамом и тазобактамом [14], к примеру амоксициллин/клавуланат, ампициллин/сульбактам и др. В клинической практике при лечении тяжелых MRSA-инфекций для создания в крови и тканях концентраций, превышающих минимальные ингибирующие, могут вводить антибиотик методом продленной инфузии или сокращать интервал между введениями высоких доз антимикробных препаратов [15]. Применение таких методик лечения инфекций ограничено стабильностью растворов антибиотиков при длительной инфузии и опасностью превышения суточной дозы препарата, рекомендованной инструкцией по медицинскому применению, что может вызвать нежелательные побочные эффекты.

В свою очередь лизостафин является крайне активным антистафилококковым агентом, применяемым для лечения стафилококковых инфекций различных локализаций, с редко встречающейся устойчивостью к его действию. В работе 2023 года было показано, что показатель МИК₅₀/МИК₉₀ лизостафина в отношении клинических штаммов MRSA в несколько раз ниже, чем у ванкомицина, что указывает на выраженную активность фермента против резистентных к антибиотикам штаммов [11].

В работе Kiri с соавторами проведено тестирование синергизма лизостафина и оксациллина против 10 изолятов оксациллин-резистентных Staphylococcus epidermidis, (МИК лизостафина ≥ 8 мкг/мл). Индекс фракционной ингибирующей концентрации (FICI) варьировал от 0,0234 до 0,2656, что указывает на синергизм. Кроме того, авторы на модели эндокардита аортального клапана у кроликов, вызванного с S. epidermidis, показали, что комбинация лизостафина и нафциллина была одинаково эффективна, как и ванкомицин в монотерапии, и значительно эффективнее, чем лизостафин или нафциллин в монотерапии [16].

В патогенезе ортопедической MRSA-инфекции значительную роль играет возможность стафилококков проникать внутрь клеток костной ткани, адгезироваться на различных металлоконструкциях и окружающих их тканях с последующим образованием микробной биопленки. Так, стафилококки становятся недоступными для системно назначаемых антимикробных препаратов и иммунной системы человека. Важно отметить, что именно субингибирующие концентрации лизостафина не только повышают чувствительность метициллин-резистентных стафилококков к бета-лактамным антибиотикам, что показало наше исследование, но и, по данным Yue с соавт., способны предупреждать микробную адгезию и биопленкообразование [17].

Кроме того, многократное снижение необходимого количества действующего вещества и его адъюванта позволяет использовать более низкие концентрации бета-лактамных антибиотиков и применять антибактериальные препараты, к которым штамм был изначально устойчив. Полученный авторами результат использования субингибирующих концентраций лизостафина позволил в несколько раз снизить МИК антибиотика в отношении клинических штаммов MRSA, выделенных от пациентов с ортопедической инфекцией, что позволит снизить экономические затраты на лечение, сократить сроки госпитализации и профилактировать возможные рецидивы инфекции.

Заключение

Полученные авторами данные убедительно демонстрируют, что субингибирующие дозы лизостафина способны повышать чувствительность MRSA к β-лактамным антибиотикам, что открывает новые возможности для дальнейшей разработки новых схем терапии MRSA-инфекций, особенно в ортопедии, где биоплёнки и внутриклеточное персистирование бактерий существенно затрудняют эрадикацию возбудителей. Выполненное авторами исследование in vitro проведено на ограниченном числе штаммов, и необходимы дальнейшие эксперименты in vivo на моделях остеомиелита или ИАИ для подтверждения эффективности и безопасности предлагаемой стратегии.