Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Меланома кожи представляет собой гетерогенное злокачественное новообразование с высокой частотой метастазирования и неблагоприятным прогнозом на поздних стадиях. Чаще всего метастазы возникают в отдаленных участках кожи и лимфатических узлах, реже – в легких, печени, головном мозге и других органах [1]. Важную роль в инвазии и метастазировании меланомы играет неоваскуляризация, индуцированная фактором роста эндотелия сосудов А (VEGF-А). Обширный ангиогенез и васкулогенная мимикрия способствуют быстрому прогрессированию заболевания [2]. Факторы роста эндотелия сосудов запускают сигнальные пути, опосредующие ангио- и лимфангиогенез, через активацию соответствующих трансмембранных рецепторов – VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, а дисрегуляция в оси VEGF/VEGFR играет значительную роль в прогрессировании меланомы и формировании лекарственной устойчивости [3].

Одним из наиболее успешных методов лечения метастатической меланомы является таргетная терапия, направленная на активирующие мутации генов. В зависимости от мутационного статуса меланому кожи подразделяют на четыре молекулярных подтипа: с мутациями BRAF, NRAS, NF1 и с тройным диким типом (Triple-WT) [4]. При наличии мутации в гене BRAF, на долю которой приходится 50% случаев меланомы кожи, сочетание ингибиторов BRAF/MEK и блокаторов иммунных контрольных точек позволило увеличить общую выживаемость пациентов [5]. В то же время при меланомах других молекулярных подтипов по-прежнему остается актуальным поиск мишеней для таргетной терапии и разработка новых стратегий лечения. Пути MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) и PI3K/AKT (фосфатидилинозитол-3-киназа и протеинкиназа B) играют ключевую роль в прогрессировании и метастазировании меланомы и регулируются рецепторными тирозинкиназами, в том числе рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) [6]. Исследования in vitro и in silico на клеточных линиях меланомы человека и экспериментальных моделях меланомы на мышах показали, что рецептор эпидермального фактора роста является перспективной терапевтической мишенью [7]. Около 89% первичных меланом кожи и 91% метастазов меланомы демонстрируют высокий уровень экспрессии EGFR. Повышенную экспрессию данного рецептора связывают с ухудшением общей выживаемости при меланоме кожи, а также с развитием резистентности к ингибиторам BRAF/MEK [6, 8]. Кроме того, активация EGFR при прогрессировании меланомы не только приводит к стимуляции различных сигнальных путей, но также способствует переключению клеток на инвазивный фенотип, связанный с потерей Е-кадгерина. В связи с этим препараты, блокирующие активность EGFR, предлагают использовать в качестве антиметастатических средств [9].

В Пятигорском медико-фармацевтическом институте на основании проведенного молекулярного конструирования был осуществлен синтез новых отечественных субстанций – производных пиримидин-4(1Н)-она, блокаторов внутреннего домена EGFR. В исследованиях in silico была подтверждена их афинность к каталитическому сайту киназного домена EGFR, аналогично применяемому в онкологии ингибитору EGFR гефитинибу (производному 4-анилинохиназолина), который был использован в качестве функционального аналога. Проведенные в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России пилотные исследования показали противоопухолевую эффективность натриевой соли 4-{2-[2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамида (6EPSVan-Na) на сингенной модели меланомы В16/F10 [10]. Данная модель характеризуется агрессивной кинетикой: ранним выходом опухоли и метастазированием в легкие и сигнальные лимфоузлы, а также активным ангиогенезом [11, 12]. Учитывая взаимосвязь EGFR- и VEGFR-сигналинга в регуляции ангиогенеза [13], представляется целесообразным исследовать влияние введения нового блокатора EGFR – 6EPSVan-Na на некоторые параметры ангиогенеза в органах метастазирования меланомы В16/F10.

Цель исследования – изучение влияния нового ингибитора EGFR – 6EPSVan-Na на уровень VEGF-A и растворимых рецепторов sVEGFR1, sVEGFR2 в легких, подмышечных и паховых лимфоузлах самок мышей при экспериментальной терапии меланомы В16/F10.

Материал и методы исследования

Исследование выполнено на 40 самках мышей линии C57BL/6, массой 25–28 г, которые были получены из филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» (Московская область). Содержание лабораторных животных осуществлялось в стандартных условиях вивария (естественное освещение, свободный доступ к пище и воде). Проведение эксперимента соответствовало требованиям Директивы 2010/63/ЕС «О защите животных, используемых для научных целей» и «Международным рекомендациям по проведению медико‑биологических исследований с использованием животных». Исследование одобрено Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (протокол №1/229 от 21.04.2025).

Были сформированы 4 группы по 10 мышей в каждой, рандомизированные по массе тела, значимых различий средней массы между группами не было (t-тест Стьюдента): основная группа – введение 6EPSVan-Na, отрицательный контроль терапии – введение воды для инъекций; положительный контроль терапии – введение гефитиниба (референтный препарат), интактная группа – без воздействий (без перевивки опухоли и введения веществ). Мышам трех групп с введениями трансплантировали подкожно в подлопаточную область справа жизнеспособные опухолевые клетки меланомы B16/F10 (штамм получен из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России) в объеме 6×105 клеток (по 0,3 мл суспензии, приготовленной в 0,9 % растворе натрия хлорида на одно животное). Гефитиниб и 6EPSVan-Na применяли в виде водных растворов, приготовленных ex tempore, и вводили по 0,1 мл на мышь: гефитиниб перорально через зонд в дозе 43,4 мг/кг массы животного (исходя из пересчета стандартной дозы гефитиниба для человека на мышь); 6EPSVan-Na внутримышечно в дозе 15,0 мг/кг массы животного. Строение, методы синтеза и физико-химические свойства 6EPSVan-Na представлены в работе [10]. Мыши из группы отрицательного контроля внутримышечно получали по 0,1 мл воды для инъекций. Введение веществ и воды начинали в день перевивки опухоли, что моделирует раннее профилактически-терапевтическое экспериментальное воздействие. Вещества (в группах с экспериментальным воздействием) и воду (в группе отрицательного контроля) вводили утром по следующей схеме: 5 дней ежедневного введения затем перерыв 2 дня, цикл повторяли дважды. Эвтаназию всех животных осуществляли на 18-е сутки эксперимента.

В ходе эксперимента фиксировали время выхода опухоли и ее объем (измерения проводили дважды в неделю). На дальнейших этапах применено простое ослепление. На этапе некропсии визуально оценивали наличие макрометастазов в легких и лимфатических узлах – подмышечных и паховых (критериями метастатического поражения лимфоузлов служили измененная пигментация и увеличение их объема). Гистологическое исследование легких и лимфоузлов проводили с использованием стандартных методов (фиксация образцов в 10% формалине, заливка в парафиновые блоки, окраска срезов толщиной 5–7 мкм гематоксилином и эозином). Микроскопию препаратов осуществляли на микроскопе Leica DMLS2 с цифровой камерой OLYMPUS Camedia C-5050. В 10% гомогенатах тканей легких, подмышечных и паховых лимфоузлов методом ИФА определяли содержание VEGF-А, sVEGFR1 и sVEGFR2. Использовали стандартные наборы компании Cusabio (Китай). Значения показателей в тканях легких, подмышечных и паховых лимфоузлов мышей интактной группы принимали за норму.

Статистический анализ данных выполнялся с применением пакета статистических программ для медицинских исследований. Нормальность распределения определяли с использованием критерия Шапиро – Уилка. В таблице результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M±m). Значимость различий долей оценивали точным критерием Фишера, различий содержания VEGF-А, sVEGFR1, sVEGFR2 – U‑критерием Манна – Уитни или t‑тестом Стьюдента в зависимости от вида распределения. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05.

Исследование было одобрено Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (протокол №1/229 от 21.04.2025).

Результаты исследования и их обсуждение

На момент эвтаназии опухоль определялась у всех экспериментальных животных. По результатам некропсии у всех (100%) мышей с меланомой B16/F10 в группе отрицательного контроля терапии, не получавших лечение, выявлено метастатическое поражение подмышечных и паховых лимфатических узлов, проявившееся увеличением их размеров и изменением окраски (серый или черный цвет), а также наличием точечных метастазов в отдельных лимфоузлах. Гистологическое исследование показало наличие тотального метастатического поражения лимфоузлов клетками меланомы, значительным нарушением архитектоники лимфоузлов. У 8 мышей (80%) обнаружены макрометастазы в легких (единичные в обоих легких или множественные точечные во всех долях обоих легких). При гистологическом изучении крупного метастаза отмечалось кровенаполнение ткани легкого, сдавление просветов дыхательных путей, деструкция альвеолярных перегородок, укрупнение краевых альвеол, замещение паренхимы легкого тканью меланомы. При этом во всех исследованных тканях органов метастазирования мышей контрольной группы содержание VEGF-A и sVEGFR1 превышало значения соответствующих показателей группы интактных животных: в подмышечных лимфоузлах – в 3,1 и 4,7 раза, в паховых лимфоузлах – в 2,3 и 5,5 раза (табл.2), в легких – в 1,5 и 1,4 раза (табл.1). По сравнению с интактной группой уровень sVEGFR2 оказался пониженным в подмышечных лимфоузлах в 1,7 раза (табл.2) и, напротив, повышенным в паховых лимфоузлах и легких – в 1,5 и 2,8 раза соответственно (табл.1, 2).

Таблица1

Содержание VEGF-А, sVEGFR1 и sVEGFR2 в тканях легких при экспериментальном воздействии на меланому B16/F10 6EPSVan-Na и гефитинибом

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (M±m). Статистически значимые различия: р1 – по сравнению с показателем в группе интактных мышей, р2 – по сравнению с показателем в контрольной группе. Критический уровень значимости р = 0,05. При множественных сравнениях (VEGF-A) критический уровень значимости р = 0,017 (поправка Бонферрони)

Таблица2

Содержание VEGF-А, sVEGFR1 и sVEGFR2 в тканях подмышечных и паховых лимфоузлов при экспериментальном воздействии на меланому B16/F10 6EPSVan-Na и гефитинибом

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (M±m). Статистически значимые различия: р1 – по сравнению с показателем в группе интактных мышей, р2 – по сравнению с показателем в контрольной группе. Критический уровень значимости р = 0,05. При множественных сравнениях (VEGF-A, sVEGFR1) критический уровень значимости р = 0,017 (поправка Бонферрони)

После воздействия гефитинибом (положительный контроль терапии) метастатическое поражение подмышечных лимфоузлов отмечено у 6 (60%) мышей группы сравнения (р=0,0867 по сравнению с отрицательным контролем), паховых лимфоузлов – у 10 (100%) мышей, одновременное поражение лимфоузлов обеих анатомических зон – у 6 (60%) животных (p=0,0867 по сравнению с отрицательным контролем). В то же время микрокартина лимфоузлов с метастатическим ростом опухоли демонстрировала характерные для апоптоза признаки гибели клеток меланомы – фрагментация ядра, конденсирование и распыление хроматина, апоптотические тельца. Только у 1 (10%) мыши выявлено метастатическое поражение левого легкого (p=0,0073 по сравнению с отрицательным контролем). Гистологическое исследование показало несколько небольших очагов метастатического роста меланомы с сохранением фенотипических черт, фигур патологического митоза, что свидетельствует о пролиферативной активности клеток опухоли. Однако на значительных участках легкого наблюдалась картина гибели опухолевых клеток аналогично микрокартине в лимфоузлах. При этом содержание VEGF-A в подмышечных лимфоузлах не отличалось от величин в группе отрицательного контроля, в паховых – возросло в 1,9 раза (табл.2), а в легких снизилось в 2,8 раза (табл.1). Также зафиксировано снижение уровня sVEGFR1 в 2,2 раза и в подмышечных, и в паховых лимфоузлах относительно значений в группе отрицательного контроля (табл.2); в легких изменений показателя не выявлено. Изменение содержания sVEGFR2 – увеличение в 1,9 раза отмечено только в подмышечных лимфоузлах по сравнению с группой отрицательного контроля (табл.2).

После терапии 6EPSVan-Na (основная группа) у 4 (40%) мышей основной группы (р=0,0108 по сравнению с группой отрицательного контроля) наблюдалось метастатическое поражение подмышечных лимфоузлов, у 7 (70%) мышей (р=0,2105 по сравнению с группой отрицательного контроля) выявлено поражение паховых лимфоузлов и только у 3 (30%) мышей (р=0,0031 по сравнению с группой отрицательного контроля) зафиксировано поражение лимфоузлов обеих анатомических зон. Гистологическое исследование показало, что в корковом слое и мякотных тяжах лимфоузлов, пораженных опухолью, сохранялись небольшие участки скопления опухолевых клеток с признаками деструктивных изменений ядра и цитоплазмы, активацией соединительнотканных элементов, формированием комплексов лимфоцитов и плазмоцитов. Это позволяет предположить, что гибель опухолевых клеток опосредована другим механизмом – мобилизацией клеточных и тканевых элементов защиты. Макрометастазы в легких животных основной группы не обнаружены, а микрокартина отдельных участков легких демонстрировала группы дистрофически измененных опухолевых клеток с гипохромными ядрами и замещением соединительной тканью. Участков с конгломерациями активно пролиферирующих клеток меланомы не обнаружено. Подобные результаты терапевтического воздействия 6EPSVan-Na сопровождались уменьшением содержания VEGF-A в подмышечных лимфоузлах и легких – в 2,1 и 2,2 раза соответственно (табл.1, 2), а также снижением уровней sVEGFR1 в паховых лимфоузлах и легких – в 1,8 и 1,5 раза соответственно по сравнению со значениями показателей в группе отрицательного контроля (табл.1, 2). Содержание sVEGFR2 возросло в паховых лимфоузлах в 1,5 раза (табл.2), но снизилось в легких в 2,3 раза (табл.1) относительно величин в группе отрицательного контроля.

Метастазирование является отличительной чертой злокачественных опухолей и служит причиной наибольшего числа смертей от онкологических заболеваний. Каскад метастазирования состоит из нескольких фаз и включает локальную инвазию и интравазацию опухолевых клеток в проксимальные кровеносные сосуды или лимфатические протоки, выживание в кровообращении, экстравазацию в отдаленных органах с последующей их колонизацией [14]. Формирование предметастатической ниши – благоприятного микроокружения опухоли в отдаленном метастатическом органе, является необходимым условием для закрепления опухолевых клеток в отдаленных органах и ускорения метастазирования [15]. Первичные опухоли и активированные CCR2+ воспалительные моноциты стимулируют экстравазацию в местах метастазирования, в том числе в легких, за счет продукции факторов проницаемости сосудов, важнейшим из которых является VEGF-А [16, 17]. Стимулирующее действие VEGF-A на сосудистую проницаемость реализуется через активацию на поверхности эндотелиальных клеток трансмембранных рецепторов VEGFR1 и VEGFR2, обеспечивающих фосфорилирование VE-кадгерина, что вызывает разрушение адгезионных и плотных межклеточных контактов [2]. После проникновения диссеминированных опухолевых клеток VEGF-А, продуцируемый опухолевыми клетками и эндотелиальными клетками предшественников костного мозга, способствует колонизации дистальных органов путем активации неоангиогенеза и создания иммуносупрессивной микросреды. Кроме того, VEGF-А запускает фенотипический переход опухолевых клеток из состояния покоя в пролиферативное состояние, тем самым способствуя метастатическому росту [18].

Важную роль в прогрессировании меланомы также играет растворимая форма рецептора фактора роста эндотелия сосудов типа 1 (sVEGFR1) [19]. Растворимые формы рецепторов VEGF-A – sVEGFR1 и sVEGFR2, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга, как правило, относят к антиангиогенным факторам. Они выполняют роль рецепторов-ловушек, регулируя распределение VEGF-А и ограничивая активацию трансмембранных рецепторов, ослабляя тем самым проангиогенную передачу сигналов [20]. Однако sVEGFR1 также оказывает проангиогенное и проопухолевое действие за счет активации интегрина β1, что приводит к стимуляции адгезии и хемотаксиса эндотелиальных и опухолевых клеток [21].

В проведенном исследовании установлено, что метастазирование меланомы В16/F10 в легкие, подмышечные и паховые лимфоузлы мышей (группа отрицательного контроля терапии) сопровождалось накоплением проангиогенных факторов VEGF-A и sVEGFR1 в этих органах. При этом более выраженное увеличение показателей, особенно sVEGFR1, отмечено в лимфоузлах. На дисбаланс в органах метастазирования оси VEGF-A/sVEGFR, регулирующей стабильность и контроль роста сосудов, указывает и динамика содержания антиангиогенного sVEGFR2: в подмышечных лимфоузлах отмечено его снижение, тогда как повышение показателя в паховых лимфоузлах и легких не компенсировало высокие уровни VEGF-A. Полученные исследователями результаты согласуются с данными других авторов. Так, экспериментальные исследования показали, что экспрессия VEGF-A в клеточных линиях, полученных из метастатических меланом, выше, чем в линиях из первичных опухолей [22]. Установлено, что метастазирование в сигнальные и отдаленные лимфатические узлы может быть обусловлено действием VEGF-A через активацию пролиферации VEGFR2-положительных клеток в лимфатических сосудах [23]. Было показано, что у больных меланомой с метастазами в сигнальных лимфатических узлах уровень VEGF-A в плазме крови статистически значимо выше, чем у пациентов с отрицательным статусом лимфатических узлов [24]. В работе [25] продемонстрировано, что клеточные линии меланомы, полученные из первичных опухолей или метастазов в лимфатических узлах, имели более высокий уровень мРНК sVEGFR1 по сравнению с меланоцитами или клеточными линиями, полученными из кожных метастазов. По мнению авторов, изменение экспрессии sVEGFR1 может выступать в качестве механизма, регулирующего пространственную локализацию метастазов [25].

В данном исследовании было установлено, что экспериментальное воздействие новым веществом и блокатором EGFR гефитинибом ингибировало метастазирование в легкие мышей с меланомой В16/F10. При этом применение и гефитиниба, и 6EPSVan-Na, способствовало существенному снижению содержания VEGF-A в легких: ниже величин в группах отрицательного контроля и интактной, а концентрации sVEGFR1 в этой ткани оказались на уровне значений, характерных для интактных животных. Кроме того, после использования 6EPSVan-Na наблюдалась нормализация содержания sVEGFR2 в легких мышей.

Применение 6EPSVan-Na, в отличие от гефитиниба, приводило к статистически значимому по сравнению с отрицательным контролем снижению частоты метастазирования меланомы в подмышечные лимфоузлы мышей и уменьшению частоты синхронного поражения лимфоузлов обеих анатомических зон. Следует отметить, что и динамика исследованных показателей в лимфоузлах разных анатомических зон отличалась у подопытных животных, получавших вещество 6EPSVan-Na или гефитиниб. После их применения в паховых лимфоузлах мышей зафиксированы однонаправленные изменения уровня sVEGFR1 и разнонаправленные – в содержании VEGF-A и sVEGFR2. Оба препарата вызывали существенное снижение концентрации sVEGFR1 в этих органах. При этом введение гефитиниба приводило к почти двухкратному нарастанию в паховых лимфоузлах уровня VEGF-A, а содержание sVEGFR2 не претерпевало существенных изменений. Напротив, после использования 6EPSVan-Na отмечено накопление sVEGFR2 при сохранном содержании VEGF-A на уровне значений отрицательного контроля. В подмышечных лимфоузлах мышей после воздействия гефтинибом происходила модуляция уровня растворимых рецепторов – уменьшение содержания sVEGFR1 и повышение sVEGFR2 до значений нормы, тогда как применение 6EPSVan-Na способствовало выраженному, более чем в два раза, снижению содержания VEGF-A относительно отрицательного контроля.

В ряде экспериментальных работ зарубежных авторов было показано, что ингибирование VEGF-A играет важную роль в ограничении метастазирования меланомы. Так установлено, что лигустразин подавлял VEGF-А индуцированное метастазирование клеток меланомы B16/F10 в легкие [26]. Ингибитор VEGF-A VIAN-c4551 блокировал индуцированную клетками меланомы вазопроницаемость легких, экстравазацию клеток меланомы B16/F10 и рост метастазов [11]. M.C. Hsieh и соавт. [27] показали, что подавление экспрессии VEGF-А конъюгатом DC-81-индола останавливает миграцию опухолевых клеток, препятствуя метастазированию. Также известно, что гефитиниб подавляет пролиферацию и инвазию клеток меланомы через сигнальный путь VEGF/AKT [28].

Полученные результаты показали, что после введения гефитиниба в лимфоузлах в ответ на снижение содержания проангиогенного sVEGFR1 происходило либо компенсаторное нарастание уровня VEGF-A, либо его стабилизация. В то же время соединение 6EPSVan-Na вызывало снижение ключевого фактора неоангиогенеза VEGF-A и в легких, и в подмышечных лимфоузлах самок мышей с меланомой В16/F10, что можно расценить как более выраженное антиангиогенное влияние, препятствующее развитию метастазов в этих органах.

Заключение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о способности нового соединения 6EPSVan-Na и ингибитора EGFR гефитиниба подавлять метастазирование меланомы В16/F10. Применение 6EPSVan-Na, аналогично гефитинибу, блокировало формирование макрометастазов в легких. Кроме того, введение 6EPSVan-Na приводило к снижению частоты метастатического поражения подмышечных лимфоузлов и синхронного поражения подмышечных и паховых лимфоузлов. Подобное влияние раннего экспериментального воздействия 6EPSVan-Na может быть связано с более сбалансированной модуляцией факторов ангиогенеза в органах метастазирования подопытных мышей, что проявлялось в первую очередь снижением содержания VEGF-A в легких и подмышечных лимфоузлах. Результаты настоящего пилотного исследования, несмотря на имеющиеся ограничения – доклиническая модель, малая численность экспериментальных групп, свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения противоопухолевых и антиметастатических эффектов вещества 6EPSVan-Na и их механизмов.