Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований в мире, занимая третье место по заболеваемости и второе по смертности среди всех онкологических заболеваний [1]. Ежегодно в мире регистрируется более 1,9млн новых случаев заболевания, а смертность достигает 935тыс. случаев в год [2]. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении, выживаемость пациентов с метастатической формой заболевания остается низкой, составляя менее 15% за пятилетний период [3].

Молекулярный патогенез КРР характеризуется накоплением генетических и эпигенетических изменений, которые приводят к нарушению нормальной регуляции клеточного цикла, апоптоза, дифференцировки и миграции [4]. Классическая модель развития КРР, предложенная Fearon и Vogelstein, описывает последовательное накопление мутаций в генах APC, KRAS, TP53 и др., приводящее к прогрессии от нормальной слизистой к аденоме и далее к аденокарциноме [4]. Особый интерес представляют раково-тестикулярные антигены (CTA) – группа белков, экспрессия которых в норме ограничена клетками зародышевой линии, но реактивируется в различных опухолях, включая КРР. Благодаря высокой иммуногенности и ограниченному профилю экспрессии CTA рассматриваются как перспективные мишени для иммунотерапии [5]. Кроме того, значительный вклад в регуляцию онкогенеза вносят некодирующие РНК – длинные некодирующие РНК (lncRNA) и микроРНК (miRNA), которые модулируют экспрессию генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях, в том числе участвуя в регуляции экспрессии раково-тестикулярных антигенов [6, 7].

В последние годы были выявлены различные молекулярные подтипы КРР, которые отличаются по клиническим проявлениям, прогнозу и ответу на терапию [8]. Проект TCGA (The Cancer Genome Atlas) предоставил беспрецедентный объем данных о геномных, транскриптомных, эпигеномных и протеомных изменениях при различных типах рака, включая КРР [9]. Для понимания основ и деталей патогенеза, а также учитывая актуальность поиска новых высокоспецифичных молекулярных маркеров для ранней диагностики и прогноза [10], необходим комплексный анализ молекулярных данных опухолевой ткани в сравнении с условно здоровой.

Цель исследования – интегративный анализ молекулярных изменений при КРР на основе данных TCGA, включая анализ копийности и экспрессии генов, экспрессии некодирующих РНК, мутационного профиля и эпигенетических аномалий, для выявления потенциальных биомаркеров.

Материал и методы исследования

Источники данных. Данные были получены из базы данных TCGA (The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov, данные загружены в марте 2024 г., версия данных: GDC Data Release 32.0). В анализ был включен 451 образец первичной колоректальной аденокарциномы (COAD – 321, READ 130). Использованы парные образцы опухоль / нормальная ткань (41 образец нормальной слизистой из TCGA, а также дополнительные нормальные ткани из базы GTEx v8 для валидации). Использовались следующие типы данных: сегментированные данные копийности, данные секвенирования экзомов (WES), данные экспрессии мРНК (RNA-seq) и данные метилирования ДНК (Illumina Infinium HumanMethylation450). Важно отметить, что были использованы предварительно обработанные данные RNA-seq образцов опухолевой и нормальной ткани толстой кишки. Для каждого гена рассчитаны медианные значения экспрессии в группах «опухоль» и «норма», логарифмическое изменение (Log2FC) и скорректированное p-значение (adj.p). Анализ включал 12345 транскриптов (уникальных Ensembl ID).

Анализ копийности генов. Для идентификации значимых амплификаций и делеций использовался алгоритм GISTIC 2.0.22 [11]. Параметры анализа: порог для амплификации: 0,1, порог для делеции: 0,1, максимальное количество сегментов на образец: 2000, ширина пика: 0,7, уровень доверия: 0,99. Значимость определялась по Q-value ≤0,25. Результаты включали: фокальные амплификации и делеции, а также изменения на уровне плеч хромосом.

Анализ экспрессии генов. Ген считался дифференциально экспрессированным (DEG) при |Log2FC| ≥1 и adj.p <0,05. Для выделения наиболее значимых изменений использован порог |Log2FC| ≥2. Для визуализации использованы библиотеки Plotly. Volcano plot построен для всех генов, отвечающих порогу по adj.p (p<0,05). Столбчатые диаграммы отображают топ-20 генов с наибольшим повышением и понижением экспрессии. Таблицы включают детальную информацию по DEG, CTA, lncRNA и miRNA. Раково-тестикулярные антигены идентифицировали на основе курируемой базы CTDatabase [12] и перекрестной проверки по литературным источникам. Длинные некодирующие РНК (lncRNA) и микроРНК (miRNA) определяли по номенклатуре Gene Symbol (наличие префиксов LINC, MIR, суффиксов -AS, а также ручная аннотация).

Анализ мутаций. Для выявления значимо мутированных генов использовался алгоритм MutSig 2CV v3.1 [13]. Критерии значимости: Q-value ≤0,1. Анализ включал оценку мутационной нагрузки, кластеризации мутаций и функционального воздействия.

Корреляционный анализ. Корреляции между копийностью генов и экспрессией мРНК оценивали с использованием коэффициента Пирсона. Корреляции между метилированием ДНК и экспрессией генов оценивались с использованием коэффициента Спирмена с применением поправки Бенджамини – Хохберга (FDR) для контроля ложноположительных результатов (Q-value ≤0,05).

Анализ обогащения сигнальных путей. Для идентификации значимо обогащенных сигнальных путей использовался гипергеометрический тест с поправкой на множественные сравнения (FDR). База данных генных наборов: MSigDB v4.0 (c2.cp).

Внешняя валидация. Для подтверждения ключевых результатов (основные амплификации/делеции, DEG, мутации) использована независимая когорта из базы GEO (GSE143985, 98 образцов КРР) и данные CPTAC (Colon Cancer, 110 образцов).

Статистический анализ. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения R v4.1.0. Для визуализации данных использовались пакеты ggplot2, pheatmap и ComplexHeatmap.

Результаты исследования и их обсуждение

Изменения копийности генов. Анализ GISTIC выявил 22 статистически значимые фокальные амплификации (Q-value ≤0,25) и 44 статистически значимые (Q-value ≤0,25) фокальные делеции (рис.1). Наиболее частые амплификации наблюдались в хромосомах 20q, 8q, 13q и 17q, что согласуется с предыдущими исследованиями при КРР [14]. Наиболее частые делеции выявлены в хромосомах 16p, 4q, 6q и 18q. Анализ на уровне плеч хромосом выявил 23 значимых результата. Наиболее частые амплификации наблюдались в плечах 20q (70% образцов), 8q (51% образцов), 13q (58% образцов), 7p (55% образцов) и 7q (50% образцов). Наиболее частые делеции выявлены в плечах 18q (61% образцов), 18p (59% образцов), 17p (57% образцов), 15q (36% образцов) и 14q (33% образцов).

Изменения экспрессии генов. В результате анализа выявлено 2847 дифференциально экспрессирующихся генов (при пороге |Log2FC|≥ 1 и adj.p <0,05), что составляет приблизительно 14% от общего числа анализируемых генов. Из них 1523 гена (53,5%) были гиперэкспрессированы в опухолевой ткани, а 1324 гена (46,5%) – гипоэкспрессированы. При более строгом пороге (|Log2FC| ≥2, adj.p <0,05) выявлено 140 дифференциально экспрессирующихся генов, из них 121 с повышенной экспрессией и 19 с пониженной.

Рис.1. Распределение амплификаций (зеленый цвет) и делеций (красный цвет) по хромосомам (топ-10).

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Наиболее значительное увеличение экспрессии (Log2FC>4) демонстрируют гены, вовлеченные в клеточную адгезию (CLDN1, CLDN2, CLDN4), пролиферацию (UBE2C, RRM2, TK1) и воспалительный ответ (CXCL8, CCL20) (рис.2).

Рис.2. Volcano plot дифференциальной экспрессии генов при КРР.

По оси X – Log2(Fold Change) опухоль/норма, по оси Y – log10(adj.p-value). 

Красные точки – значимо повышенная экспрессия (adj.p <0,05, Log2FC>1), синие – значимо пониженная (adj.p <0,05, Log2FC <-1).

Серые точки – незначимые изменения. Горизонтальная линия соответствует adj.p = 0,05, вертикальные – Log2FC = ±1.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Среди генов с выраженным снижением (Log2FC <-4) – компоненты мышечного сокращения (ACTG2, MYH11, CNN1, DES) и гены, ассоциированные с нормальной функцией стромы (ADAM33, DPT) (рис.2 и 3).

Рис.3. Топ-20 генов с наиболее выраженным повышением (слева) и понижением (справа) экспрессии в опухоли относительно нормальной ткани. Значения представлены как Log2(Fold Change).

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

В анализируемом наборе данных идентифицировано 3 гена, относящихся к семейству раково-тестикулярных антигенов (РТА). Большинство из них показали повышенную экспрессию в опухолевых образцах (табл.1).

Среди наиболее значимых – MAGEA3, MAGEA6, PRAME. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, указывающими на реактивацию РTA при КРР [15].

Таблица1

РТА, дифференциально экспрессирующиеся при КРР

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Также выявлено 23 дифференциально экспрессированных микроРНК, включая miR-21 (log2FC = 2,8, adjp = 1,2e-45), которая известна как онкогенная микроРНК, способствующая пролиферации и инвазии клеток КРР.

Таблица2

МикроРНК, дифференциально экспрессирующиеся при КРР

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Идентифицировано 156 lncRNA с измененной экспрессией. Среди них CRNDE (Colorectal Neoplasia Differentially Expressed) показал log2FC = 2,66 (adjp = 1,82e-102). Эта lncRNA способствует пролиферации клеток КРР через активацию Wnt/β-катенинового сигнального пути [16].

Таблица3

lncRNA, дифференциально экспрессирующиеся при КРР

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Корреляция копийности генов, экспрессии мРНК и эпигенетических изменений. Анализ выявил 5440 генов с положительной корреляцией между показателями копийности и экспрессией мРНК (90-й перцентиль). Наиболее сильные корреляции (>0,8) наблюдались для генов на хромосоме 20 (рис.4).

Рис.4. Распределение коэффициентов корреляции копийности и экспрессии генов. Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Анализ выявил сильную отрицательную корреляцию между метилированием ДНК и экспрессией генов. Наиболее сильные отрицательные корреляции (< -0,8) наблюдались для генов, представленных на рис.5.

Мутационный профиль. Анализ MutSig 2CV выявил 1436 значимо мутированных генов (q ≤ 0,1 в GDAC-отчете). Биологическая значимость выявленных мутаций требует дополнительной фильтрации. Наиболее часто мутированные гены представлены на рис.6.

Рис.5. Отрицательная корреляция метилирования промоторов и экспрессии генов. Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Рис.6. Частота мутаций в топ-15 генах при КРР.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Обогащение сигнальных путей. Анализ обогащения выявил 229 значимо измененных сигнальных путей (q ≤0,01). Наиболее значимые пути представлены на рис.7.

Рис.7. Топ-10 обогащенных сигнальных путей при КРР.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Изменения копийности генов. Выявленные амплификации в 20q, 8q и 13q согласуются с предыдущими исследованиями КРР [17]. Хромосома 20q содержит ряд онкогенов, включая AURKA, TPX2, BCL2L1 и MYBL2, которые играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза и хромосомной сегрегации [18]. Амплификация 8q24.21 включает ген MYC, который является ключевым регулятором пролиферации, метаболизма и апоптоза опухолевых клеток [19]. Амплификация 13q12.13 затрагивает ген USP12, который кодирует дубиквитинирующую протеазу и может способствовать стабилизации онкогенных белков [20]. Делеции в 16p, 4q и 6q затрагивают потенциальные супрессоры опухолей. Регион 16p13.3 содержит ген CREBBP, который функционирует как коактиватор транскрипции и регулятор ацетилирования гистонов [21]. Делеции в 18q включают гены SMAD2, SMAD4 и DCC, которые являются ключевыми компонентами сигнального пути TGF-β и регуляторами клеточной адгезии [22]. Делеция 4q22.1 затрагивает ген CCKAR (холецистокининовый рецептор), который может играть роль в регуляции пролиферации эпителиальных клеток [23]. Интересно, что амплификации в 7p и 7q наблюдались в 55и 50% образцов соответственно. Хромосома 7 содержит гены EGFR (7p11.2) и BRAF (7q34), которые являются ключевыми компонентами сигнального пути MAPK и потенциальными мишенями для таргетной терапии [24].

Транскриптомный профиль. Проведенный анализ подтвердил значительные изменения транскриптомного профиля в опухолях толстой кишки. Среди генов с максимальным повышением экспрессии – CLDN1, CLDN2, CLDN4, кодирующие белки плотных контактов; их гиперэкспрессия характерна для КРР и ассоциирована с инвазивностью [25]. Гены UBE2C, RRM2, TK1 отражают высокую пролиферативную активность опухолевых клеток. Повышение CXCL8, CCL20 указывает на провоспалительное микроокружение, способствующее опухолевой прогрессии [26]. Снижение экспрессии генов гладкомышечного сокращения (ACTG2, MYH11, CNN1, DES) является отражением ремоделирования стромы и потери мышечного слоя при инвазии опухоли. Гены CAV1, CAV2, кодирующие кавеолины, также значительно подавлены, что может влиять на сигнальные пути TGF-β и Wnt [27].

Выявленные раково-тестикулярные антигены (MAGEA3, MAGEA6, PRAME) представляют особый интерес для разработки вакцин и адоптивной иммунотерапии КРР, поскольку их экспрессия практически отсутствует в нормальных соматических тканях взрослого человека [28]. Полученные данные подтверждают их значительную активацию в опухолях толстой кишки.

Роль некодирующих РНК в патогенезе КРР. МикроРНК относятся к коротким некодирующим РНК, которые регулируют экспрессию генов, катализируя разрушение мРНК, либо ингибируя трансляцию мРНК в белок [29]. МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая инициацию онкогенеза, прогрессирование и метастазирование опухолей, что делает микроРНК потенциальными биомаркерами для оценки прогрессирования и прогноза КРР. Хотя микроРНК регулируют экспрессию генов, кодирующих белки, главным образом посредством деградации или сайленсинга мРНК, появляется все больше свидетельств того, что микроРНК могут взаимодействовать с lncRNA, что, в свою очередь, также обеспечивает регуляцию экспрессии генов-мишеней [30]. Выявленные микроРНК и lncRNA участвуют в ключевых сигнальных путях канцерогенеза. Так, miR-21, наиболее изученная онкогенная микроРНК при КРР, подавляет экспрессию опухолевых супрессоров PTEN и PDCD4, способствуя пролиферации и выживанию опухолевых клеток [31]. miR-143/miR-145 кластер – пониженная экспрессия этих опухолевых супрессорных микроРНК характерна для КРР. Они регулируют экспрессию KRAS, MYC и других онкогенов [32]. lncRNA CRNDE действует как «спонж» для miR-181a-5p, модулируя Wnt/β-катениновый сигнальный путь. Высокая экспрессия CRNDE коррелирует с плохим прогнозом [16]. Пониженная экспрессия lncRNA HOTAIRM1 (log2FC = -1,82) ассоциирована с прогрессией КРР через регуляцию генов HOXA кластера [33].

Мутационный профиль. Высокая частота мутаций в генах APC (65% пациентов) и TP53 (51% пациентов) подтверждает их ключевую роль в патогенезе КРР [34]. Мутации в гене APC приводят к конститутивной активации сигнального пути Wnt/β-catenin, что является ранним событием в развитии КРР. Мутации в гене TP53 нарушают функции опухолевого супрессора p53, включая контроль клеточного цикла, апоптоз и репарацию ДНК [35]. Мутации в гене KRAS (45% пациентов) являются важным прогностическим и предиктивным фактором. Мутации KRAS ассоциированы с резистентностью к анти-EGFR терапии (цетуксимаб, панитумумаб) [36]. Мутации в гене PIK3CA (22% пациентов) активируют сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR, что способствует пролиферации и выживанию опухолевых клеток [37]. Мутации в гене ARID1A (16% пациентов) указывают на нарушение комплекса SWI/SNF, что согласуется с данными о его роли в хроматиновом ремоделировании и регуляции транскрипции [38]. Мутации в гене RNF43 (10% пациентов) указывают на нарушение регуляции сигнального пути Wnt через убиквитинирование рецепторов франтиза [39]. Мутации в гене MLH1 (4% пациентов) указывают на дефекты системы репарации неспаренных оснований (MMR), что характерно для микросателлитно-нестабильных (MSI) опухолей [40]. Однако частота мутаций в гене MLH1 в проведенном исследовании ниже, чем ожидаемая для спорадических КРР с дефицитом MMR, что может указывать на эпигенетические механизмы инактивации этого гена.

Корреляция копийности и экспрессии генов. Сильные положительные корреляции между копийностью и экспрессией генов (> 0,8) наблюдались для генов на хромосоме 20 (PSMF1, PTPRA, YTHDF1, RTFDC1, TRPC4AP). Это указывает на то, что амплификации в этих регионах функционально значимы и приводят к увеличению экспрессии соответствующих генов [41]. Ген PSMF1 кодирует протеасомный ингибитор, который может способствовать выживанию опухолевых клеток через ингибирование протеасомной деградации онкогенных белков [42]. Ген PTPRA кодирует протеин-тирозинфосфатазу, которая может регулировать сигнальные пути, включая Src и MAPK [43]. Ген YTHDF1 кодирует белок, связывающийся с м6А-модифицированной мРНК и регулирующий трансляцию, что может способствовать экспрессии онкогенов [44].

Эпигенетические изменения. Сильная отрицательная корреляция между метилированием промоторов и экспрессией генов подтверждает важную роль эпигенетических механизмов в регуляции транскрипции при КРР. Гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей является одним из ключевых механизмов их инактивации [45]. Ген LY6G6D, показавший наиболее сильную отрицательную корреляцию (r = -0,88), кодирует белок, связанный с GPI-якорем, функция которого при КРР не до конца изучена [46]. Ген GJB5 кодирует коннексин 31.1, который участвует в формировании щелевых контактов и может регулировать межклеточную коммуникацию [47]. Ген FAM50B экспрессируется преимущественно в яичках, и его роль при КРР требует дальнейшего изучения [48].

Сигнальные пути. Значимое обогащение путей, связанных с канцерогенезом, иммунной системой и сигнальными каскадами, указывает на комплексность молекулярных изменений при КРР. Обогащение путей адгезии (адгеренс-юнкшн, фокальная адгезия) согласуется с ролью нарушений клеточной адгезии в инвазии и метастазировании [35]. Обогащение путей, связанных с иммунной системой, указывает на важную роль иммунного микроокружения в прогрессии КРР. Это согласуется с данными о том, что иммунная инфильтрация является важным прогностическим фактором при КРР [35]. На рис.8 представлена итоговая схема молекулярных изменений при КРР.

Ключевые результаты (основные амплификации 20q, 8q и делеции 18q, мутации APC/KRAS, повышение MAGEA3) были подтверждены в независимой когорте GSE143985 (98 образцов) и данных CPTAC (Colon Cancer). Коэффициенты корреляции копийность – экспрессия для генов-кандидатов (PSMF1, YTHDF1) составили 0,75–0,82 (p<0,001).

Рис.8. Интегративная схема молекулярных изменений при КРР.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Ограничения исследования. Несмотря на масштаб интегрированного анализа, исследование имеет ряд ограничений: проведен ретроспективный анализ данных TCGA, а это предполагает возможные систематические смещения (batch effects) при малой представленности нормальных тканей (относительно опухолевых) и учитывая обработку образцов в разных центрах. Также нами не проводилась функциональная валидация (необходимы эксперименты in vitro/in vivo), не учитывалось детально влияние молекулярных подтипов (MSI, CIMP, CIN) опухоли и неоднородность COAD/READ. При этом статистический список 1436 мутированных генов не эквивалентен клинически значимым драйверным мутациям; требуется дополнительная фильтрация.

Заключение

Таким образом, выявлены изменения копийности, включая амплификации в 20q (70%), 8q (51%), 13q (58%), 7p (55%) и 7q (50%), и делеции в 18q (61%), 18p (59%), 17p (57%), 16p (25%) и 4q (30%), которые затрагивают ключевые онкогены и супрессоры опухолей. Также идентифицировано 1436 значимо мутированных генов, включая классические онкогены APC – 65%, TP53 – 51%, KRAS – 45%, PIK3CA – 22%, а также гены ARID1A – 16%, RNF43 – 10% и FBXW7 – 13%. Обнаружены сильные корреляции между копийностью и экспрессией генов (>0,8 для 5440 генов), а также между метилированием ДНК и транскрипцией (<-0,8 для 25 генов).

Выявлено значимое изменение 229 сигнальных путей, включая пути канцерогенеза, иммунной системы, клеточной адгезии и ключевые онкогенные сигнальные каскады (Wnt, MAPK, PI3K, TGF-β, p53). Обнаружено повышение экспрессии РТА (MAGEA3, PRAME и др.) в опухолевой ткани, что поддерживает их потенциал как иммунотерапевтических мишеней. Результаты исследования имеют потенциальное значение для разработки персонализированных подходов к лечению КРР, включая таргетную терапию и иммунотерапию. Полученные данные не предназначены для непосредственного применения в клинической практике без дополнительной валидации.