Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение. Плоскоклеточный рак кожи (ПРК) является вторым по частоте злокачественным новообразованием кожи после базальноклеточного рака. Заболеваемость ПРК продолжает расти во всём мире, что связано со старением населения, увеличением инсоляции и улучшением диагностики [1; 2]. По данным международного агентства по изучению рака (IARC), ежегодный прирост заболеваемости ПРК составляет 2-3% в развитых странах [3]. Актуальной проблемой остаётся ранняя дифференциальная диагностика предраковых состояний кожи (эпидермальных дисплазий, актинического кератоза) и инвазивного ПРК, поскольку тактика ведения пациентов существенно различается в зависимости от степени дисплазии [3]. Неправильная диагностика может привести как к недостаточному лечению с последующей прогрессией заболевания, так и к избыточной терапии с травматизацией пациента.

Дисплазия кожи и ПРК характеризуются специфическими молекулярными изменениями, в первую очередь затрагивающими гены, участвующие в росте клеток, дифференцировке и репарации ДНК. Эти изменения включают мутации в генах - супрессорах опухолей, таких как TP53 и CDKN2A, а также активацию онкогенов, таких как EGFR и CCND1 [3-5]. Выделяют несколько степеней эпидермальной дисплазии (актинического кератоза): 1-я степень (лёгкая, KIN 1) - атипия кератиноцитов ограничена нижней 1/3 эпидермиса, низкий риск малигнизации (≤5%), 2-я степень (умеренная, KIN 2) - атипичные клетки распространяются до 2/3 толщи эпидермиса, средний риск малигнизации (15-20%), 3-я степень (тяжёлая, KIN 3) - атипия во всех слоях эпидермиса, высокий риск малигнизации (≥60%) [6; 7].

Актинический кератоз (АК) считается предшественником ПРК и характеризуется молекулярными изменениями, в том числе мутациями TP53 и инактивацией CDKN2A [4; 6]. ПРК имеет схожие молекулярные характеристики с АК, но при инвазивном ПРК генетические изменения часто более многочисленны и выражены тяжелее [6-8].

В последние годы уровень экспрессии определённых микроРНК стал рассматриваться в качестве прогностических и диагностических молекулярных маркеров [9; 10]. МикроРНК - это короткие некодирующие РНК (18-25 нуклеотидов), которые регулируют экспрессию генов, катализируя разрушение мРНК либо ингибируя трансляцию мРНК в белок. Одна микроРНК может таргетировать сотни генов-мишеней, что делает их мощными регуляторами клеточных процессов [11].

МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая инициацию онкогенеза и прогрессирование опухолей [12; 13]. Важным преимуществом микроРНК как биомаркеров является их стабильность в биологических жидкостях, включая плазму крови, что открывает возможности для малоинвазивной диагностики [14]. Поэтому целью настоящей работы стало выявление молекулярных маркеров эпидермальных дисплазий разной степени и плоскоклеточного рака кожи для улучшения малоинвазивной дифференциальной диагностики данных заболеваний.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на выборке из 230 участников в период с 2021 по 2025 год (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика участников исследования

Примечание: составлено авторами на основе анализа клинических данных.

Критериями включения в исследование были следующие: возраст >18 лет; гистологически подтверждённый диагноз; подписанное информированное согласие; общее удовлетворительное состояние; отсутствие других злокачественных опухолей в анамнезе. Критериями невключения были: наличие других злокачественных опухолей; сопутствующая патология в стадии декомпенсации; отсутствие морфологической верификации; возраст <18 лет; проведение системной терапии в течение последних 6 месяцев.

На первом этапе работы проведён биоинформационный анализ открытых баз данных, включая TCGA (The Cancer Genome Atlas), DisGeNET, cBioPortal и GTEx. Анализ позволил установить ключевые гены, участвующие в развитии дисплазий и ПРК: CDKN2A, TP53, EGFR и NOTCH1. Поиск микроРНК таргетирующих гены-мишени, осуществляли с использованием метода машинного обучения Random forest. Результатом модели Random forest является предсказанная вероятность того, что микроРНК является истинным регулятором конкретного гена [15]. Критерии отбора микроРНК-кандидатов были следующие: вероятность связывания (binding probability) ≥ 0,95, энергия связывания ≤ -19,0 ккал/моль, наличие консервативного seed-региона и подтверждение в минимум двух базах данных (TargetScan, miRDB).

Препараты РНК плазмы крови получали при помощи модифицированного протокола Chomczynski и Sacchi [16]. К 300 мкл плазмы последовательно прибавляли 400 мкл денатурирующего буфера (6М гуанидин-изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, рН 6,5, 1% Sarkosyl, 2% 2-меркаптоэтанол) и 70 мкл 2М ацетата натрия, pH 4,0. К полученной смеси добавляют 700 мкл насыщенного водой фенола и перемешивают. Для разделения водной и органической фаз прибавляют 200 мкл смеси «хлороформ:изоамиловый спирт» (49:1), перемешивают в течение 10 сек. и инкубируют в течение 15 мин. при 4 °C. Затем полученную смесь центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин. при 2 °С. Верхнюю водную фазу отбирают и переносят в новую пробирку. К водной фазе прибавляют равный объем этанола и наносят на колонку с фильтром из диоксида кремния (использовали колонки из набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия), РНК эффективно связывается с мембраной из диоксида кремния). Колонку дважды промывают буфером (4M гуанидин-изотиоцианат, 10 мМ трис-ацетат, 50% этанол, 1% 2-меркаптоэтанол) и центрифугируют. Затем колонку дважды промывают буфером (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 75% этанол), центрифугируют при 400 g, 1 мин. Для элюции РНК в колонку добавляют 120 мкл деионизированной воды с ингибитором РНКаз. Элюат собирают центрифугированием при 400 g, 10 мин. [17].

Для выявления зрелых микроРНК выделенную суммарную РНК подвергали реакции обратной транскрипции, которая проводилась одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров (обратный праймер, содержащий олиго(dT)-последовательность и адаптерную последовательность на 5'-конце). Реакцию проводили в течение 30 мин. при 22 °C, 15 мин. при 40 °C, затем обратную транскриптазу инактивировали в течение 5 минут при 85 °C.

Полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовали в реакциях RT-qPCR. Амплификацию проводили в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1x ПЦР-буфер, 0,25 мМ dNTPs, 2 мМ MgCl2, 1x EvaGreen, 1 ед. акт. Taq-DNA-полимеразы, по 400 нМ прямого и обратного праймеров. Постановку RT-qPCR каждого образца проводили в трёх повторах на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: 2 минуты 95°C, 50 циклов: денатурация при 95°C 10 с, отжиг и элонгация – 64°C 20 с. Относительную экспрессию микроРНК вычисляли следующим образом: рассчитывали среднее геометрическое Ct по трём повторам для целевой и референсной микроРНК, далее рассчитывали величину ΔCt =Ct(целевая микроРНК) – Ct(hsa-miR-7-5p) и коэффициент относительной экспрессии (eK) по формуле 1.9-ΔCt [18].

Нормальность распределения оценивали с помощью теста Шапиро - Уилка. Поскольку распределение уровней экспрессии микроРНК отличалось от нормального, для описания данных использовали медиану (Me) и интерквартильный размах (Q1-Q3). Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью критерия Краскела - Уоллиса с последующим попарным сравнением по методу Дунна с поправкой на множественные сравнения (пост-хок-тест). Уровень статистической значимости принимали при p < 0,05. Все статистические расчёты выполняли в программной среде R версии 4.2.0 с использованием пакетов glmnet, pROC и ggplot2. Для получения надёжной диагностической модели использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию, оптимизированную при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных. LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) позволяет одновременно выполнять отбор переменных и регуляризацию модели, что особенно важно при работе с высокоразмерными данными [19].

Работа выполнена с использованием научного оборудования ЦКП НМИЦ онкологии МЗ РФ (регистрационный номер 3554742, https://ckp-rf.ru/catalog/ckp/3554742/).

Результаты исследования и их обсуждение

Биоинформатический анализ взаимодействия микроРНК и генов-мишеней. На основании анализа баз данных TCGA и DisGeNET, а также литературы были установлены ключевые гены, участвующие в развитии дисплазий и ПРК. Поиск микроРНК, таргетирующих гены-мишени, позволил составить первоначальный перечень из 13 кандидатов. После применения критериев отбора и валидации методом Random Forest были выделены 4 наиболее перспективные микроРНК (табл. 2).

Таблица 2

Основные микроРНК и их гены-мишени, участвующие в патогенезе ПРК (результаты биоинформационного скрининга)

Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Биоинформатический анализ показал, что все отобранные микроРНК имеют высокую вероятность связывания с 3'UTR регионами целевых генов. Энергия связывания варьирует от -19,0 до -30,4 ккал/моль, что указывает на стабильность комплексов микроРНК-мРНК. Особенно сильное связывание наблюдается для hsa-miR-937-5p с TP53 (-30,4 ккал/моль) и hsa-miR-326 с NOTCH1(-29,4 ккал/моль). Анализ консервативности seed-регионов показал, что все выбранные микроРНК имеют консервативные seed-последовательности, что подтверждает их эволюционную значимость и функциональную важность в регуляции экспрессии генов-мишеней.

Экспрессия микроРНК в тканях и плазме крови. Валидация выбранных микроРНК методом RT-PCR в образцах тканей и в плазме крови показала значимые различия между группами пациентов. Статистически значимые различия наблюдались по всем четырём микроРНК как в ткани, так и в плазме (p < 0,001 по критерию Краскела - Уоллиса, табл. 3).

Таблица 3

Уровни экспрессии микроРНК в тканях и плазме крови у пациентов с дисплазиями и ПРК

Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля (условно нормальной ткани или плазмы доноров, p < 0,001). Таблица составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования,

Анализ данных показал, что экспрессия hsa-miR-423-5p постепенно возрастает от дисплазии 1-2 степени к ПРК. В плазме крови наблюдается более выраженная динамика по сравнению с тканью, что может быть связано с активной секрецией экзосомальных микроРНК опухолевыми клетками. Различия между группами статистически значимы (p < 0,001). Для hsa-miR-937-5p наблюдается аналогичная тенденция к повышению экспрессии при прогрессировании заболевания. Наибольшие значения наблюдаются при ПРК. Коэффициент вариации в группе ПРК составил 25,5%, что указывает на гетерогенность опухоли. Значения в нормальной ткани были в 2,8 раза ниже, чем в ткани ПРК (p < 0,0001).

Экспрессия hsa-miR-155-5p снижается при переходе от дисплазии к ПРК. Данная микроРНК известна как онкосупрессор в контексте ПРК, и её снижение может способствовать активации сигнального пути EGFR. При ПРК наблюдается снижение экспрессии более чем в 5 раз по сравнению с дисплазией 1-2 степени (Me 0,000025 против 0,00014 в плазме, p < 0,001). Наиболее выраженное снижение экспрессии hsa-miR-326 выявлено при ПРК по сравнению с дисплазиями (в 38 раз в ткани и в 37 раз в плазме, p < 0,001). Эта микроРНК таргетирует NOTCH1, и её снижение может приводить к активации сигнального пути NOTCH, что способствует прогрессии опухоли. Корреляционный анализ Спирмена показал сильную положительную корреляцию между уровнями экспрессии микроРНК в ткани и плазме крови (r = 0,82-0,89, p < 0,001), что подтверждает возможность использования плазмы крови для малоинвазивной диагностики.

A. hsa-miR-423-5p

B. hsa-miR-937-5p

C. hsa-miR-155-5p

D. hsa-miR-326

Рис. 1. Box-plot диаграммы экспрессии микроРНК в ткани и плазме крови у пациентов с дисплазиями разной степени и ПРК (по оси Y - относительная экспрессия (eK), Box показывают 25-75 перцентили, линия внутри box - медиана, whiskers - минимальные и максимальные значения без выбросов).

Составлено авторами по результатам данного исследования

LASSO-пенализованный регрессионный анализ. Для выявления наиболее информативных микроРНК-маркеров был проведён LASSO-пенализованный логистический регрессионный анализ. Метод LASSO позволяет одновременно выполнять отбор переменных и регуляризацию модели, что особенно важно при работе с высокоразмерными данными и ограниченным размером выборки [20].

Математическая модель LASSO минимизирует следующую функцию потерь:

L(β) = -log-likelihood + λ × Σ|βj| ,

где λ - параметр регуляризации, βj - коэффициенты регрессии для каждой микроРНК. Оптимальное значение λ подбирали методом кросс-валидации (10-fold).

В результате анализа с использованием множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных (1000 итераций) были отобраны 4 микроРНК с наибольшей прогностической ценностью (табл. 4).

Таблица 4

Результаты LASSO-регрессионного анализа для выявления маркерных микроРНК

Примечание: таблица составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Положительные коэффициенты для hsa-miR-423-5p и hsa-miR-937-5p указывают на то, что повышение их экспрессии ассоциировано с повышенным риском прогрессирования заболевания. Отрицательные коэффициенты для hsa-miR-155-5p и hsa-miR-326 свидетельствуют об обратном: снижение их экспрессии коррелирует с развитием ПРК. VIP score (Variable Importance in Projection) показывает относительную важность каждой переменной в модели. hsa-miR-326 имеет наивысший VIP score (1,67), что делает её наиболее информативным маркером для дифференциации дисплазии 3 степени и ПРК.

Для построения мультимаркерной панели применили LASSO-логистическую регрессию к данным экспрессии четырёх микроРНК в плазме. Поскольку задача состояла в последовательном различении трёх клинически значимых категорий (дисплазия 1–2, дисплазия 3, ПРК), использовали два бинарных классификатора: первый - для отделения дисплазии 1-2 от более тяжёлых поражений (объединённая группа дисплазия 3 + ПРК); второй - для разделения дисплазии 3 и ПРК. При optim.lambda = 0,023 (первый классификатор) в модель были включены miR-423-5p и miR-937-5p с положительными коэффициентами. Во втором классификаторе (lambda = 0,018) значимыми предикторами оказались miR-155-5p и miR-326 с отрицательными коэффициентами (рис. 2). ROC-анализ подтвердил высокую точность обеих моделей. Для первой модели AUC = 0,98 (95% ДИ 0,96–0,99), чувствительность 95%, специфичность 92% при пороге вероятности 0,5. Для второй модели AUC = 0,97 (95% ДИ 0,94–0,99), чувствительность 94%, специфичность 90% (рис. 2). Комбинированное использование двух этапов позволило достичь общей точности классификации 93%.

На основании полученных данных разработан диагностический алгоритм с использованием коэффициентов относительной экспрессии микроРНК (eK). На основе распределения значений eK в группах определены оптимальные пороги по индексу Юдена (табл. 5). При eKmiR-423≤ 1,11×10-3и eKmiR-937≤ 7,01×10-3 диагностируется дисплазия 1–2 степени; при превышении этих порогов показано дополнительное определение miR-155-5p и miR-326. Значения eKmiR-155≥ 5,17×10-5 и eKmiR-326≥ 8,24×10-3 соответствуют дисплазии 3 степени, а более низкие - ПРК.

Рис. 2. ROC-кривые для оценки диагностической точности модели на основе микроРНК. AUC = 0,98 (95% CI: 0,96-0,99).

Составлено авторами по результатам данного исследования

Таблица 5

Диагностические пороги и операционные характеристики

Примечание: таблица составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Алгоритм включает двухэтапную диагностику. На этапе 1 происходит разделение групп здоровых доноров, пациентов с дисплазией 1-2 степени и пациентов с дисплазией 3 степени/ПРК. При eKmiR-423≤ 1,11×10-3 и eKmiR-937 ≤ 7,01×10-3- диагностируют дисплазию 1-2 степени (чувствительность 90%, специфичность 92%). При eKmiR-423≥ 2,09×10-3 и eKmiR-937 ≥ 7,95×10-3 - диагностируют дисплазию 3 степени или ПРК (чувствительность 95%, специфичность 91%). На этапе 2 происходит дифференциация дисплазии 3 степени и ПРК. При eKmiR-155 ≥ 5,17×10-5 и eKmiR-326 ≥ 8,24×10-3- диагностируют дисплазию 3 степени (чувствительность 95%, специфичность 93%). При eKmiR-155≤ 3,52×10-5 и eKmiR-326≤ 6,45×10-3- диагностируют ПРК (чувствительность 94%, специфичность 92%). При значениях коэффициента eK между указанными интервалами результат считают неопределённым и рекомендуют дополнительное обследование (повторный анализ через 4-6 недель или биопсия).

Для оценки воспроизводимости метода был проведён анализ внутрилабораторной вариабельности. Коэффициент вариации (CV) для внутрилабораторных повторностей составил 4,2-6,8%, что соответствует принятым стандартам для молекулярно-диагностических тестов. Полученные данные демонстрируют высокий диагностический потенциал анализа микроРНК в плазме крови для дифференциальной диагностики эпидермальных дисплазий и ПРК. Чувствительность 90-95% и специфичность 90% (AUC 0,98) превосходят показатели традиционных методов диагностики, таких как дерматоскопия (чувствительность 75-85%) и цитологическое исследование (чувствительность 70-80%) [21].

Биоинформатический анализ подтвердил биологическую обоснованность выбора микроРНК-маркеров. Все отобранные микроРНК таргетируют ключевые гены канцерогенеза кожи. Так, hsa-miR-423-5p таргетирует CDKN2A- регулятор клеточного цикла, кодирует белки p16INK4a и p14ARF. Инактивация CDKN2A наблюдается в 60-80% случаев ПРК [22]. hsa-miR-937-5p → TP53 - главный супрессор опухолей, мутации в TP53 обнаруживаются в 90% случаев ПРК и 50% случаев актинического кератоза [23]. hsa-miR-155-5p → EGFR - рецептор эпидермального фактора роста, гиперэкспрессия EGFR наблюдается в 70-90% ПРК и ассоциирована с агрессивным течением [24]. А hsa-miR-326 → NOTCH1 - сигнальный путь дифференцировки кератиноцитов, мутации NOTCH1 являются ранним событием в канцерогенезе кожи [25]. Изменения экспрессии этих микроРНК в плазме крови отражают молекулярные процессы, происходящие в опухолевой ткани, что делает их надёжными жидкостными биомаркерами. Механизм появления микроРНК в плазме включает активную секрецию через экзосомы, пассивное высвобождение при апоптозе и некрозе клеток, а также связывание с белками (Ago2) и липопротеинами высокой плотности [26]. Известно, что инактивация CDKN2A (p16) и мутации TP53 являются ранними событиями в развитии актинического кератоза [3]. Повышение уровня miR-423-5p и miR-937-5p, нацеленных соответственно на CDKN2A и TP53, может отражать попытку клеток подавить экспрессию этих супрессоров. Примечательно, что в тканях дисплазии 3 и ПРК наблюдается дальнейший рост этих микроРНК, что согласуется с нарастанием генетической нестабильности. С другой стороны, снижение miR-155-5p (мишень - онкоген EGFR) и miR-326 (мишень - NOTCH1) при переходе от дисплазии 3-й степени к инвазивному раку может свидетельствовать о переключении сигнальных путей: если на стадии carcinoma in situ сохраняется высокая экспрессия этих микроРНК, возможно, сдерживающая пролиферацию, то при инвазии происходит их эпигенетическое сайленсирование, что ведёт к дерепрессии EGFR и NOTCH1 и ускорению опухолевого роста. Аналогичные данные получены для плоскоклеточного рака других локализаций [12].

Таким образом, применение LASSO-регрессии позволило подтвердить значимость выбранных микроРНК и количественно оценить их вклад. Высокие значения AUC свидетельствуют о превосходной дискриминационной способности модели.

Заключение

В ходе исследования впервые комплексно проанализированы молекулярные особенности (транскриптомные) ПРК и эпидермальных дисплазий разной степени. В настоящем исследовании впервые предложена малоинвазивная панель из 4 микроРНК плазмы крови для дифференциальной диагностики различных стадий эпидермальной дисплазии и ПРК. Выбор микроРНК базировался на биоинформатическом предсказании их взаимодействия с ключевыми генами канцерогенеза кожи: CDKN2A, TP53, EGFR и NOTCH1. Применение результатов исследования в клинической практике специалистов онкологического профиля позволит повысить эффективность лечения ПРК за счёт ранней диагностики и своевременного вмешательства.