Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Йодсодержащие гормоны, секретируемые щитовидной железой, обладают исключительно широким спектром биологического действия и участвуют в регуляции практически всех основных физиологических процессов – прежде всего энергетического обмена и терморегуляции, роста и онтогенетического развития, функциональной активности сердечно-сосудистой и нервной систем, потребления кислорода тканями, а также действия иных гормонов и биоактивных соединений, включая контроль над уровнем холестерина и глюкозы. Эти соответствующие эффекты реализуются как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровнях [1, 2]. Звенья гипоталамус – передняя доля гипофиза – щитовидная железа формируют единый саморегулирующийся функциональный контур, известный как гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось. Ее работа начинается с образования тиреолиберина в гипоталамусе, который запускает секрецию тиреотропного гормона аденогипофизом, а тот, в свою очередь, стимулирует выработку тиреоидных гормонов самой железой, при этом согласованность этих звеньев поддерживает механизмы отрицательной обратной связи и тиреоидный гомеостаз [3]. Ослабление гормонообразующей функции железы ведет к гипотиреозу, а ее избыточная активность – к гипертиреозу, причем клиническая картина этих состояний прямо противоположна: прибавка или потеря массы тела, плохая переносимость холода либо жары, бради- либо тахикардия, запор либо диарея и множество иных проявлений [4, 5].

Главным продуктом секреции щитовидной железы служит биологически малоактивный тетрайодтиронин (Т4 или тироксин), который выступает предшественником активной формы – трийодтиронина (Т3), образующегося в клетках-мишенях путем отщепления одного атома йода при участии дейодиназ. Помимо самого йода, входящего в структуру тиреоидных гормонов, для их полноценного синтеза и функциональной активности критически важны селен, железо, цинк, медь, магний, а также витамины А и В12. При дефиците этих нутриентов секреция гормонов падает, что способствует формированию кретинизма, зоба, микседемы и гипотиреоза [6]. В то же время длительная нагрузка избыточными количествами йода также оказывается патогенной. Так, в эксперименте ежедневное введение крысам йодида калия в дозе 3,5 мг / 100 г на протяжении 60 суток сопровождалось развитием гипотиреоза, гипергликемией, гиперхолестеринемией, повышением уровня триглицеридов и липопротеинов низкой и очень низкой плотности, снижением липопротеинов высокой плотности, истощением гликогеновых депо в печени и скелетных мышцах при одновременном его накоплении в миокарде и почках, что способствовало развитию сердечно-сосудистой и почечной патологии [7].

В кровотоке тиреоидные гормоны переносятся в связанной форме, преимущественно с тироксин-связывающим глобулином, транстиретином и альбумином, а в зоне действия диссоциируют от белков-носителей и поступают в клетки либо путем простой диффузии, либо через специализированные мембранные переносчики. К настоящему времени установлено, что наибольшей специфичностью к тиреоидным гормонам обладают монокарбоксилатные транспортеры 8 и 10, а также органические анионные транспортные полипептиды С1 и А4 [8]. Поскольку ядерные рецепторы щитовидной железы обладают значительно более высоким сродством именно к Т3, ключевое значение приобретают дейодиназы. Первый и второй типы этих ферментов локализованы в печени, почках, мышцах и самой железе, тогда как третий тип преобладает в центральной нервной системе и плаценте. Этими ферментами осуществляется превращение Т4 либо в активный Т3, либо в биологически инертный реверсивный Т3 [9]. Эффекты Т3 опосредуются высокоаффинными ядерными рецепторами α и β, активация которых в конечном счете приводит к экспрессии белков – модуляторов транскрипции и регуляторов метаболических процессов [10].

Необходимость настоящей работы обусловлена тем, что почки, будучи высокочувствительными к кислородному режиму и функционально тесно связанными с эффектами тиреоидных гормонов, как регуляторов энергетического обмена, должны активно реагировать на изменения тиреоидного статуса, но каким образом протекает это реагирование при уже имеющемся повреждении паренхимы – вопрос, остающийся недостаточно изученным. Хотя в настоящее время в зарубежной литературе описаны исследования как по изучению функции почек при гипер- и гипотиреозах, так и наоборот, как хроническая болезнь почек может вторично вызвать изменения состояния щитовидной железы [11, 12]. Но эти все исследования проспективно когортные и кросс-секционное, и в них не описаны механизмы изменений, а для расчета скорости клубочковой фильтрации, как основного показателя почечной недостаточности, проводятся не по классическим показателям (с учетом уровня креатинина в моче, плазме крови и диурезу), а по модифицированным методам [13].

Цель исследования – воспроизвести у лабораторных крыс экспериментальные модели гипертиреоза, нефропатии, а также гипертиреоза на фоне нефропатии и в каждой из этих моделей оценить ионовыделительную функцию почек, с выяснением того, какие процессы меняются в почках при обработке ионов, а также определить интенсивность перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты как фундаментальных показателей гомеостаза, меняющихся в зависимости от общего состояния организма.

Материал и методы исследования

В работе были использованы 48 половозрелых самцов крыс линии Wistar полугодовалого возраста с массой тела 190–230 г (в среднем 210 ± 18 г). На первом этапе у всех животных в интактном состоянии собирали контрольные данные: каждую крысу помещали в индивидуальную обменную клетку на 6 ч для получения спонтанно выделяющейся мочи, а ее объем затем пересчитывали в часовой диурез в расчете на 100 г массы (мл/ч/100 г).

В собранных пробах мочи методом пламенной фотометрии (пламенный фотометр ПФА-378, Россия) определяли концентрации натрия и калия [14], после чего рассчитывали показатели их экскреции (мкмоль/ч/100 г) и фильтрационной загрузки (мкмоль/ч/100 г); дополнительно для натрия вычисляли величину канальцевой реабсорбции (%) и экскретируемую фракцию (%). По завершении сбора мочи 12 животным внутрибрюшинно вводили 0,1 мл / 100 г общего анестетика с выраженным снотворным эффектом золетил (Франция) и через несколько минут после развития неподвижности крыс декапитировали. В плазме полученной артерио-венозной крови тем же методом пламенной фотометрии измеряли концентрации натрия и калия, а содержание гидроперекисей и малонового диальдегида (маркеры липопероксидации) и активности каталазы и супероксиддисмутазы (показатели антиоксидантной защиты) определяли спектрофотометрически (спектрофотометр UNICO 2800, США) [15].

Оставшиеся 36 животных распределили на три равные группы по 12 особей, моделируя: в группе 1 – гипертиреоз, в группе 2 – нефропатию, в группе 3 – гипертиреоз на ранее сформированную нефропатию.

Моделью гипертиреоза служило ежедневное двухнедельное внутрижелудочное зондовое введение левотироксина натрия (Берлин-Хеми, Германия) в дозе 5,0 мкг / 100 г [16]. В литературе имеются работы, в которых крысам вводили дозу, превышающую использованную в этой работе, в 10 раз и продолжительнее [17]. Авторы поставили цель воспроизвести именно гипертиреоз – состояние, значительно чаще встречающееся в клинике, а не тиреотоксикоз, регистрируемый реже. Левотироксин натрия представляет собой синтетический аналог натриевой соли L-тироксина с периодом полувыведения 6–7 суток, то есть он способен накапливаться в организме и оказывать свои эффекты.

Нефропатию воспроизводили троекратным внутримышечным введением глицерина (нефротоксикант) в дозе 0,8 мл / 100 г. Первая инъекция и спустя две недели – вторая, третья – еще через две недели, так что общий период составлял один месяц. Такая схема определялась особенностями метаболизма крыс: из-за интенсивного обмена веществ однократная инъекция вызывает у них острые, но обратимые изменения, которые в среднем за две-три недели купируются. Требовалось исследовать действие гипертиреоза на уже хронически поврежденные почки, а хронизация нефропатии, как правило, устанавливается не ранее чем через три месяца от ее дебюта. Тем не менее в предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что как морфологические, так и функциональные почечные сдвиги после трехкратного введения глицерина в указанной дозе оказываются сопоставимыми в конце второго и третьего месяцев [18], что позволяет считать двухмесячную нефропатию хронической. Исходя из этого, крысам группы 3 сначала индуцировали почечную недостаточность, после чего спустя две недели от последней инъекции глицерина начинали двухнедельный курс левотироксина натрия (в той же дозе 5,0 мкг/100 г), а исследование показателей выполнялось в самом конце второго месяца от начала моделирования нефропатии.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета GraphPad Prism 6.03. Достоверность различий средних величин контрольной и экспериментальных групп с учетом нормальности распределения оценивалась по t-критерию Стьюдента с минимальным уровнем значимости р<0,05.

Разрешение на проведение экспериментов, содержание животных, уход за ними и выведение из опыта с применением обезболивания получены в соответствии с действующими правилами работы с лабораторными животными (приказ Минздравсоцразвития России №708н от 23 августа 2010 г.) и согласно разрешению этического комитета академии (протокол №9.5 от 29 ноября 2019 г.).

Результаты исследования и их обсуждение

Авторами в ранее опубликованных работах [18] было показано, что двухнедельное введение левотироксина в дозе 5,0 мкг / 100 г сопровождалось статистически значимым (р<0,001) ростом концентраций свободных три- и тетрайодтиронинов в плазме крови в 2,0 и 1,9 раза соответственно, при двухмесячной нефропатии, напротив, их уровни достоверно снижались (р<0,05), а в условиях гипертиреоза, сформированного на фоне почечного поражения, наблюдаемое повышение гормонов (р<0,001) оказалось менее выраженным, чем при изолированном гипертиреозе (р<0,05). Вероятно, такое смягчение тиреоидного ответа связано с характерной для нефропатии протеинурией, уменьшающей пул транспортных белков, а также с возможным нарушением всасывания йода, лимитирующим биосинтез гормонов [18]. Водовыделительная функция почек во всех трех экспериментальных группах изменялась однонаправленно – в сторону повышения диуреза, однако механизмы этого повышения различались. Так, при нефропатии ключевую роль играло снижение канальцевой реабсорбции воды, тогда как при гипертиреозе и при его сочетании с поражением почек – ускорение клубочковой фильтрации [19].

Анализ ионовыделительной функции показал, что в экспериментальной группе 1 плазменные концентрации натрия и калия значимо не менялись, что проявилось тем, что для натрия регистрировалась лишь тенденция к повышению, а для калия – к снижению (рис.1).

Рис.1. Содержание натрия и калия в плазме крови у крыс с гипертиреозом, нефропатией и гипертиреозом на фоне нефропатии.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Экскреция натрия с мочой снижалась с 9,54±0,57 мкмоль/ч/100 г до 7,61±0,29 мкмоль/час/100 г (р<0,05) (рис.2). Причиной такого гипонатрийуреза несмотря на то, что фильтрационный заряд натрия статистически значимо (р<0,01) превышал контрольные значения на 44,98% (рис.3), стало усиление канальцевой реабсорбции иона (р<0,05) (рис.4), сопровождавшееся уменьшением экскретируемой фракции с 0,45±0,06 до 0,24±0,05% (р<0,05).

Рис.2. Экскреция натрия и калия у крыс с гипертиреозом, нефропатией и гипертиреозом на фоне нефропатии.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Экскреция калия, напротив, возрастала (р<0,05) (рис.2), и наиболее вероятной ее причиной следует считать увеличение фильтрационного заряда иона, также статистически значимо отличавшееся от контроля (р<0,01) (рис.3). Судить о величине канальцевой реабсорбции калия напрямую затруднительно, поскольку этот катион, помимо прочего, подвергается активной секреции. Однако едва ли секреция вносила существенный вклад в зафиксированный калийурез: экскреция иона превышала контрольные показатели на 28,12%, что практически совпадало с приростом фильтрационной загрузки (29,47%).

Рис.3. Фильтрационный заряд натрия и калия у крыс с гипертиреозом, нефропатией и гипертиреозом на фоне нефропатии.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

У животных экспериментальной группы 2, которым моделировалась нефропатия, к концу второго месяца регистрировалось статистически значимое снижение плазменных концентраций как натрия, так и калия (рис.1). Одновременно изменялся и характер их почечной обработки. Так, выделение натрия с мочой в сравнении с контролем возросло в 1,8 раза (рис.2), что явилось следствием достоверного ослабления его канальцевой реабсорбции (рис.4) и увеличения экскретируемой фракции с 0,45±0,06% до 1,05±0,10% (р<0,001). Вклад фильтрационного заряда в возросшую экскрецию в данном случае следует исключить, так как он, напротив, оказался сниженным (рис.3).

Рис.4. Канальцевая реабсорбция и экскретируемая фракция натрия у крыс с гипертиреозом, нефропатией и гипертиреозом на фоне нефропатии.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Аналогично возрастала (в 1,91 раза) и экскреция калия (рис.2), причем на фоне уменьшения его фильтрационной загрузки относительно контроля в 1,55 раза. Такое соотношение указывает на то, что возникающее при нефропатии повреждение канальцевого аппарата затрагивает как реабсорбцию, так и секрецию иона, причем последняя, по-видимому, интенсифицируется, что и определяет отмеченный калийурез.

В экспериментальной группе 3, где гипертиреоз развивался на фоне уже сформированной нефропатии, плазменные концентрации натрия и калия (рис.1) снижались, достоверно отличаясь как от контроля (натрий р<0,01; калий р<0,02), так и от изолированного гипертиреоза (натрий р<0,001; калий р<0,05). Иначе говоря, комбинация гипертиреоза с нефропатией приводит к развитию гипонатри- и гипокалиемии.

Выявленное снижение ионных концентраций в крови объяснялось возрастанием их экскреции с мочой. В частности, натрийурез увеличивался в 2,18 раза (рис.2), причем причиной тому служили как прирост фильтрационного заряда иона (р<0,05) (рис.3), так и ослабление его канальцевой реабсорбции (р<0,01) (рис.4).

Таким образом, модель гипертиреоза характеризовалась снижением экскреции натрия с мочой за счет усиленной канальцевой реабсорбции; нефропатия к концу второго месяца давала противоположный эффект – натрийурез нарастал вследствие подавления реабсорбции иона; наиболее выраженное повышение экскреции натрия возникало при сочетании нефропатии с гипертиреозом и было обусловлено одновременным действием двух механизмов – увеличением фильтрационной загрузки и снижением канальцевой реабсорбции.

Экскреция калия при гипертиреозе, развивающемся на фоне нефропатии, статистически значимо превышала значения контроля (в 2,37 раза, р<0,01), гипертиреоза (в 1,85 раза, р<0,001) и нефропатии (в 1,24 раза, р<0,05). При этом фильтрационный заряд иона был выше, чем при нефропатии, но уступал как контрольным данным, так и особенно показателям при гипертиреозе. Следовательно, ключевым механизмом столь выраженного калийуреза в условиях сочетанной патологии выступает усиленная тубулярная секреция калия, обусловленная комбинированным повреждением канальцевого эпителия – как нефротоксическим действием глицерина, так и эффектами гипертиреоза, в том числе морфологическим повреждением нефроцитов, увеличением почечного кровотока и скорости клубочковой фильтрации, ранее описанными [17, 18], а также нарастанием окислительного стресса, первоначально затрагивающего митохондрии, а затем и клетку в целом (см. ниже). Суммарно эти процессы ведут к функциональным и структурным изменениям почечной ткани.

Оценка состояния перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной защиты показала, что при гипертиреозе концентрации гидроперекисей и малонового диальдегида возрастали до 7,25±0,59 мкмоль/л и 50,06±3,35 мкмоль/л соответственно против контрольных значений 5,16±0,42 мкмоль/л (р<0,002) и 36,49±2,77 мкмоль/л (р<0,01). Параллельно усиливалась и активность антиоксидантных ферментов: каталазы с 4,66±0,31×10⁻⁴ МЕ/1 г Hb в контроле до 6,22±0,43×10⁻⁴ МЕ/1 г Hb (р<0,01); супероксиддисмутазы с 61,58±3,25 ед. ингибир. до 80,25±3,86 ед. ингибир. (р<0,002). Одновременное нарастание процессов липопероксидации и активности антиоксидантных ферментов позволяет заключить, что повышение в крови уровней три- и тетрайодтиронинов, ускоряющих метаболизм, стимулирует и свободнорадикальное окисление липидов, и компенсаторный ответ антиоксидантной системы. Очевидно также, что двухнедельное введение L-тироксина не приводит к истощению антиоксидантного ресурса.

При нефропатии на фоне нарастающей липопероксидации, проявлявшейся ростом концентраций гидроперекисей (на 73,25%) и малонового диальдегида (на 57,44%), фиксировалось ослабление активности ферментов антиоксидантной защиты: каталазы на 64,08%, супероксиддисмутазы на 30,48%. Когда же гипертиреоз моделировался на фоне нефропатии к концу второго месяца, интенсификация окислительного поражения липидов достигала еще более высоких значений: содержание гидроперекисей превышало контроль в 2,27 раза, а малонового диальдегида – в 1,7 раза. Активность антиоксидантных ферментов, напротив, угнеталась значительнее: каталазы – в 1,8 раза, супероксиддисмутазы – в 1,42 раза.

Таким образом, при экспериментальном двухнедельном гипертиреозе уровни как липопероксидации, так и антиоксидантной активности согласованно возрастают. Нефропатия, напротив, сопровождается разнонаправленной динамикой, проявляющейся нарастанием свободнорадикального окисления липидов при одновременном ослаблении ферментного звена антиоксидантной защиты. Присоединение же гипертиреоза к токсическому поражению почек углубляет окислительный стресс и еще более подавляет антиоксидантный резерв.

Выводы

1. Экспериментальный гипертиреоз, воспроизведенный у крыс линии Вистар двухнедельным пероральным введением левотироксина натрия в дозе 5,0 мкг / 100 г, сопровождается снижением экскреции натрия с мочой за счет усиленной канальцевой реабсорбции иона, нарастанием калийуреза вследствие увеличения его фильтрационной загрузки, а также параллельным подъемом интенсивности пероксидации липидов и активности ферментов антиоксидантной защиты.

2. Экспериментальная нефропатия, сформированная у крыс линии Вистар троекратным внутримышечным введением нефротоксиканта глицерина, к концу второго месяца приводит к снижению плазменных концентраций натрия и калия и к повышению их выделения с мочой: для натрия вследствие подавления канальцевой реабсорбции, для калия, по-видимому, вследствие усиленной секреции. Одновременно на фоне активации пероксидации липидов регистрируется ослабление ферментативного звена антиоксидантной защиты.

3. Гипертиреоз, развивающийся на фоне экспериментальной нефропатии, ведет к еще более выраженному снижению содержания натрия и калия в плазме крови и росту их экскреции с мочой: натрийурез обусловлен одновременным повышением фильтрационной загрузки и ослаблением обратного всасывания иона, тогда как калийурез, вероятно, связан с изменениями в канальцевом транспорте. Параллельно в еще большей степени возрастают концентрации гидроперекисей и малонового диальдегида и углубляется угнетение активности каталазы и супероксиддисмутазы.