Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Современная онкогематология продолжает сталкиваться с проблемой рефрактерности к стандартной терапии при диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфоме (ДВКЛ). Несмотря на применение современных протоколов лечения, включающих иммунохимиотерапию, у 30–40% пациентов развивается рецидив или резистентность к терапии [1]. Формирование неблагоприятного исхода связано не только с молекулярными особенностями опухолевых клеток, но и с состоянием иммунного микроокружения. Показано, что состав и функциональная активность иммунных клеток, включая Т-лимфоциты и NK-клетки, ассоциированы с прогнозом при ДВКЛ [2]. Нарушение противоопухолевого иммунного надзора способствует прогрессированию заболевания и снижению чувствительности к терапии.

Терапевтическое воздействие может быть направлено как на опухолевые клетки, так и на модуляцию иммунного ответа, способного привести к улучшению прогноза и повышению эффективности терапии [3]. В связи с этим одним из перспективных направлений является поиск подходов к целенаправленной регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток. В настоящее время активно изучаются различные иммуномодулирующие агенты, среди которых особый интерес представляет берберин – природный алкалоид, демонстрирующий противоопухолевую активность в доклинических исследованиях [4, 5]. Известно, что берберин способен индуцировать апоптоз опухолевых клеток и подавлять их пролиферацию [6, 7]. В экспериментальных моделях ДВКЛ показано, что берберин способен усиливать противоопухолевый иммунный ответ [8]. Кроме того, описано его влияние на функциональную активность B- и T-лимфоцитов [9].

В то же время влияние берберина на функциональные характеристики иммунокомпетентных клеток у пациентов с ДВКЛ изучено недостаточно.Исследование его воздействия на мононуклеарные клетки периферической кровиможет способствовать выявлению новых предикторов ответа на терапию, разработке персонализированных подходов к лечению, а следовательно, улучшению клинических исходов у пациентов с ДВКЛ.

Цель исследования – провести сравнительную оценку исходного иммунного статуса и функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) при воздействии берберина in vitro у пациентов с ДВКЛ с противоположным клиническим ответом на терапию.

Материал и методы исследования

В основу исследования положен анализ двух клинических случаев впервые диагностированной ДВКЛ с идентичной стадией заболевания по классификации Ann Arbor и сопоставимыми значениями международного прогностического индекса (IPI), но принципиально различными клиническими исходами терапии первой линии: достижение полного метаболического ответа и раннее прогрессирование заболевания с летальным исходом.

Все пациенты прошли комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование в соответствии с действующими стандартами диагностики агрессивных В-клеточных лимфом. Терапия первой линии проводилась по схеме R-CHOP (ритуксимаб 375 мг/м², циклофосфамид 750 мг/м², доксорубицин 50 мг/м², винкристин 1,4 мг/м², преднизолон 100 мг).

Был осуществлен забор периферической крови до начала химиотерапии с последующим проведением общего анализа крови на автоматическом гематологическом анализаторе Mindray BC-30s (Mindray, Китай), оценкой иммунного статуса методом проточной цитометрии, а также выделением мононуклеарных клеток из периферической крови и исследованием влияния берберина на их функциональные характеристики в опытахin vitro. Иммунофенотипированиелейкоцитов периферической крови проводили методом проточнойцитометриинацитофлуориметреBDFACSCanto(BectonDickinson,USA) с использованиемпанелеймоноклональных антител(табл.1) в соответствии с инструкцией фирм-производителей по стандартному протоколу для данного типа исследований.

Таблица1

Панели моноклональных антител

Примечание: составлена авторами на основе использованных материалов в ходе исследования

Вторым этапом работы в ходе экспериментальной части in vitro оценивалось влияние берберина на выделенные мононуклеарные клетки периферической крови. Кровь, собранную в пробирки с ЭДТА (Минимед, Россия), разводили неполной средой RPMI 1640 (Биолот, Россия) в соотношении 1:1 и наносили на фиколл 1,077 г/см3 (Биолот, Россия), после чего центрифугировали 30 мин при 1275 g. Далее собирали кольцо мононуклеаров в приготовленные пробирки с буфером Дальбекко (Биолот, Россия) без ионов кальция и магния, содержащим 2% фетальной коровьей сыворотки (Биолот, Россия), после чего центрифугировали 15 мин при 125 g. В полученной клеточной суспензии проводили подсчет количества живых клеток в камере Горяева с трипановым синим 0,4% (Биолот, Россия). Пролиферативный ответ исследовали с помощью анализа колониеобразования. Известно, что под действием митогенного стимула Т-клетки образуют колонии, являющиеся потомками одной клетки [10].

Оценка количества и размера колоний является классическим подходом при анализе пролиферативной активности Т-клеток под действием различных факторов [11]. В данной работе примененамодифицированнаяверсияклассического протокола, который предполагал использование агара. Мононуклеарные клетки высаживали по 10 тыс. клеток на лунку 96-луночного планшета в полной питательной среде (ППС) RPMI1640 (Биолот, Россия) с добавлением 10% фетальной коровьей сыворотки (Gibco, США).

Предварительно был проведен подбор подходящих концентраций берберина (в данной работе результаты не представлены). В результате тестовых экспериментов было установлено, что при инкубации в течение 72 ч концентрации берберина выше 4мкМ оказывают выраженное цитотоксическое действие на МНПК, в то время как диапазон 1–4мкМ позволяет оценивать функциональные эффекты без значимого снижения жизнеспособности клеток. На основании полученных данных для дальнейших функциональных исследований МНПКin vitroбыли выбраны концентрации берберина 1, 2 и 4мкМ как не оказывающие выраженного цитотоксического действия и позволяющие оценить его иммуномодулирующее влияние.

Для индукции пролиферативного ответа использовали фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 4мкг/мл. Экспериментальные условия включали пробы без митогенной стимуляции (интактный контроль и МНПК с берберином в концентрациях 1, 2 и 4мкМ) и пробы с митогенной стимуляцией (позитивный контроль – МНПК + ФГА, а также МНПК + ФГА в сочетании с берберином в концентрациях 1, 2 и 4мкМ). Каждый вариант опыта выполняли в четырех технических повторах.

Культивирование проводили в течение 72 ч в условиях 5% CO₂ при 37°C. По окончании инкубации в лунки добавляли ядерный краситель Hoechst233342 (Sigma Aldrich, США) (1 мг/мл) с последующей документацией и количественным анализом колоний на автоматическом клеточном анализаторе Lionheart FX (BioTek, США). В исследовании определяли количество колоний (объект с диаметром, превышающим средний диаметр ядра одиночной клетки на изображении) на лунку и среднюю площадь колоний.

Для описания данных использовали среднее значение и стандартное отклонение. Ввиду ограниченного размера выборки (n=2) статистическая обработка данных не проводилась. Интерпретация данных носит описательный и сравнительный характеры. Работа носит пилотный характер и направлена на выявление тенденций и формирование гипотез для последующих исследований на расширенной выборке.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «НМИЦ онкологии» МЗ РФ (рег. № 3554742, https://ckp-rf.ru/catalog/ckp/3554742/).

Результаты исследования и их обсуждение

Клинические характеристики обследованных

Пациент 1. Мужчина, 69 лет. По данным обследования установлен диагноз ДВКЛ стадии IIАE: выявлено поражение левой верхнечелюстной пазухи, ячеек решетчатой кости слева и левой орбиты (рис.1, А). ИГХ-исследование биоптата мягких тканях левой верхнечелюстной пазухи показало: CD20+, Bcl-2+, MUM1+/-, Bcl-6-/+, CD10-, CD23-, Cyclin D1-, индекс пролиферативной активности Ki-67 – 80%. На основании профиля экспрессии (CD10-, Bcl-6-/+, MUM1+/-) опухоль отнесена к non-GCB подтипу. Сопутствующая патология: ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь III стадии, хроническая болезнь почек (ХБП) 3А стадии (расчетная скорость клубочковой фильтрации, рСКФ, по формуле CKD-EPI – 48 мл/мин/1,73 м²), ожирение III степени. Перед началом терапии уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) был в пределах нормы (167 Е/л). После проведения шести курсов терапии по схеме R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон), по данным ПЭТ/КТ зарегистрирован полный метаболический ответ.

Пациент 2. Мужчина, 63 лет. По результатам обследования установлен диагноз ДВКЛ IIА стадии: выявлено поражение правой небной миндалины и лимфоузлов шеи (рис.1, Б). ИГХ-исследование биоптата лимфоузла шеи справа показало: CD20+, Bcl-2+, Bcl-6+/-, MuM1+, CD10-, c-MYC+/-, индекс пролиферации Ki-67 – ~95%. Морфологическая и иммунофенотипическая характеристика соответствовала ДВКЛ высокой степени злокачественности (High-grade). Сопутствующая патология: ишемическая болезнь сердца, хроническая сердечная недостаточность I стадии (ФК 2), сахарный диабет 2 типа, ХБП смешанного генеза 4 стадии (СКФ по CKD-EPI-27,1 мл/мин/1,73 м²). Перед началом терапии уровень ЛДГ был в пределах нормы (200 Е/л). Пациенту была назначена терапия первой линии по схеме R-CHOP. После проведения первого курса химиотерапии было отмечено раннее прогрессирование заболевания. В связи с резистентностью опухоли и развитием полиорганной недостаточности пациент скончался.

Рис.1. Аксиальный срез компьютерной томографии. Красной стрелкой отмечена область патологического очага. А – пациент 1; Б – пациент 2.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Сводные данные по пациентам представлены в табл. 2.

Таблица2

Сравнительная характеристика пациентов с ДВКЛ

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Анализ показателей периферической крови, проведенный до начала химиотерапии, позволил выявить различия между пациентами. У пациента с благоприятным клиническим исходом отмечались более высокие исходные значения общего числа лейкоцитов, а также абсолютного содержания нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. В то же время уровень нейтрофил-лимфоцитарного индекса был ниже по сравнению с пациентом с летальным исходом заболевания (табл.3). Выявленные различия могут свидетельствовать о наличии количественных нарушений иммунной системы у пациента с прогрессирующим течением заболевания.

Таблица3

Лабораторные данные пациентов до начала лечения

Примечание: RBC – эритроциты, HGB – гемоглобин, WBC – лейкоциты, NEUT – нейтрофилы, LYMPH – лимфоциты, MONO – моноциты, EO – эозинофилы, BASO – базофилы, NLR – нейтрофил-лимфоцитарный индекс.

Составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Сравнительный анализ исходного иммунного статуса пациентов продемонстрировал выраженные различия в субпопуляционном составе лейкоцитов периферической крови (рис.2). У пациента с благоприятным клиническим исходом отмечалось повышение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов, CD4⁺-клеток, NK- и NKT-клеток, а также T-регуляторных клеток и моноцитов. В то же время у пациента с неблагоприятным исходом преобладали гранулоциты и цитотоксические CD8⁺-клетки.

Выявленные различия могут отражать особенности формирования противоопухолевого иммунного ответа у пациентов с различным клиническим исходом заболевания. Преобладание гранулоцитов и функционально истощенных CD8⁺-клеток у пациента с неблагоприятным исходом может указывать на дисбаланс иммунной регуляции. Накопление гранулоцитарного звена и истощенных CD8⁺-клеток ассоциировано с формированием иммуносупрессивного опухолевого микроокружения, снижением эффективности противоопухолевого иммунного контроля и прогрессированием заболевания, что продемонстрировано, в частности, для ДВКЛ [12]. Аналогично CD8⁺-лимфоцитам, NK-клетки в опухолевом микроокружении могут приобретать истощенный фенотип, что сопровождается снижением их цитотоксической активности и способствует иммунному уклонению опухоли [13]. Напротив, повышенное содержание CD4⁺-клеток, а также сохранность функциональной активности NK- и NKT-клеток, вероятно, отражают более сбалансированное взаимодействие врожденного и адаптивного звеньев иммунной системы и ассоциированы с более эффективным противоопухолевым иммунным надзором [14].

Рис.2. Инициальный иммунофенотип клеток периферической крови пациентов с ДВКЛ. Лф – лимфоциты, мон – моноциты, гран – гранулоциты, Т-реr – Т-регуляторные клетки.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

При исследовании чувствительности мононуклеарных клеток периферической крови к берберинуin vitroбыло выявлено стимулирующее влияние берберина на их пролиферативную способность, проявлявшееся увеличением количества и площади формируемых колоний. При этом благоприятный клинический исход ассоциировался не с более высокой базальной колониеобразующей активностью, а с формированием более крупных колоний, что может отражать наличие лимфоцитарных клонов с более высоким пролиферативным и метаболическим потенциалом. Это позволяет предположить, что прогностическое значение может иметь не общее число клеток, а качественные характеристики клонального пролиферативного ответа (рис.3, 4).

Рис.3. Микрофотографии образовавшихся колоний мононуклеарных клеток периферической крови пациента с благоприятным исходом: а – контрольная проба, б – контрольная проба с добавлением ФГА, в – проба с добавлением 1мкмоль/л берберина, г – проба с добавлением 1мкмоль/л берберина и ФГА, д – проба с добавлением 2мкмоль/л берберина, е – проба с добавлением 2мкмоль/л берберина и ФГА, ж – проба с добавлением 4мкмоль/л берберина, з – проба с добавлением 4мкмоль/л берберина и ФГА.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Рис.4. Микрофотографии образовавшихся колоний мононуклеарных клеток периферической крови пациента с неблагоприятным исходом: а – контрольная проба, б – контрольная проба с добавлением ФГА, в – проба с добавлением 1мкмоль/л берберина, г – проба с добавлением 1мкмоль/л берберина и ФГА, д – проба с добавлением 2мкмоль/л берберина, е – проба с добавлением 2мкмоль/л берберина и ФГА, ж – проба с добавлением 4мкмоль/л берберина, з – проба с добавлением 4мкмоль/л берберина и ФГА.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

У пациента с благоприятным клиническим ответом изначально отмечалась более низкая базальная колониеобразующая активность МНПК: количество колоний было на 56% меньше по сравнению с пациентом с рефрактерным течением заболевания, однако их средняя площадь превышала данный показатель на 22%. Воздействие берберина в исследованных концентрациях вызывало дозозависимое усиление колониеобразующей способности МНПК у обоих пациентов, при этом наибольшая стимуляция наблюдалась при сочетанном применении берберина и фитогемагглютинина, что свидетельствует о синергическом эффекте изучаемого соединения с митогенной стимуляцией (рис.5, 6). Использование ФГА позволило оценить влияние берберина в условиях активированной иммунной реакции, что приближаетмодель in vitro к условиям реализации противоопухолевого иммунного ответаin vivo.

Кроме того, были выявлены индивидуальные различия в чувствительности МНПК к берберину: у пациента с полным ответом на терапию наибольшее увеличение количества колоний наблюдалось при концентрации 1мкмоль/л, тогда как у пациента с неблагоприятным исходом пик пролиферативного ответа смещался на 2мкмоль/л (рис.5). Полученные различия могут объясняться особенностями метаболической и пролиферативной активности отдельных лимфоцитарных клонов. Более крупные колонии у пациента с благоприятным исходом могут отражать наличие клонов с высоким метаболическим потенциалом и способностью к интенсивному клеточному делению, тогда как большее число, но мелких колоний у пациента с неблагоприятным исходом может соответствовать функционально менее активным клональным линиям.

Рис.5. Количество образовавшихся колоний мононуклеарных клеток периферической крови при добавлении различных концентраций берберина. К – контроль, К + ФГА – контроль + ФГА, Б1 – берберин 1мкмоль, Б1 + ФГА – берберин 1мкмоль + ФГА, Б2 – берберин 2мкмоль, Б2 + ФГА – берберин 2мкмоль + ФГА, Б3 – берберин 4мкмоль, Б3 + ФГА – берберин 4мкмоль + ФГА.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Анализ средней площади колоний позволил оценить качественные характеристики пролиферативного ответа МНПК при воздействии берберина и его комбинаций с ФГА (рис.6). У пациента с благоприятным клиническим исходом колонии отличались более крупными размерами, что указывает на наличие лимфоцитарных клонов с высоким пролиферативным и метаболическим потенциалом. Эти наблюдения подчеркивают, что размер колонии, а не только общее количество пролиферирующих клеток может быть важным показателем функциональной активности клеточных клонов и их потенциальной способности к эффективному противоопухолевому иммунному надзору.

Рис.6. Средняя площадь образовавшихся колоний мононуклеарных клеток периферической крови при добавлении различных концентраций берберина.

К – контроль, К + ФГА – контроль + ФГА, Б1 – берберин 1мкмоль, Б1 + ФГА – берберин 1мкмоль + ФГА, Б2 – берберин 2мкмоль, Б2 + ФГА – берберин 2мкмоль + ФГА, Б3 – берберин 4мкмоль, Б3 + ФГА – берберин 4мкмоль + ФГА.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Представленное описание двух случаев выявило различия в исходном иммунном статусе, функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови и их чувствительности к берберину in vitro у пациентов с противоположным клиническим ответом на терапию ДВКЛ. Следует отметить, что наблюдаемые различия могут быть связаны не только с воздействием берберина, но и с исходными биологическими различиями опухолевых клеток, в частности с различными молекулярными подтипами [15]. Полученные данные соответствуют результатам других исследований, демонстрирующих важную роль иммунного микроокружения в патогенезе ДВКЛ и ответа на терапию [2, 16].

Выявленные иммунофенотипические различия, в частности более высокое содержание NK-клеток и соотношение CD4+/CD8+-лимфоцитов у пациента с благоприятным прогнозом, согласуются с литературными данными о важности клеточного иммунитета в контроле над опухолевым ростом при лимфопролиферативных заболеваниях [17, 18].

Заключение

В работе на примере двух клинических случаев ДВКЛ показано, что функциональное состояние мононуклеарных клеток периферической крови и их реакция на иммуномодулирующее воздействие берберинаin vitroмогут различаться в зависимости от клинического исхода. Наблюдения указывают на потенциальную значимость качественных характеристик пролиферирующих клеток, таких как размер колоний и метаболический потенциал, а также исходного иммунного статуса для формирования эффективного противоопухолевого ответа. Полученные данные обосновывают необходимость дальнейших исследований на более широких выборках для подтверждения выявленных тенденций.