Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Современная медицина придает важное значение гипоксическим процессам и стресс-индуцированным факторам в патогенезе широкого спектра хронических сердечно-сосудистых, нейродегенеративных заболеваний, нарушений обмена веществ, онкологий и др. [1; 2]. Одним из ключевых последствий гипоксии считают нарушение окислительного фосфорилирования, сопровождающееся в том числе повышенной генерацией свободных радикалов, активацией процессов перекисного окисления липидов и формированием окислительного стресса, что в совокупности инициирует каскад клеточной дисфункции, апоптоз клеток и прогрессирование органной недостаточности [3; 4]. Эмпирические данные подтверждают терапевтический потенциал применения средств, направленных не только на коррекцию прямых нарушений оксигенации, но и на нейтрализацию процессов липидной пероксидации, выраженность которых коррелирует с тяжестью гипоксических поражений [2; 5]. В связи с этим особое внимание уделяется препаратам растительного происхождения с высоким содержанием флавоноидов, фенольных соединений, аминокислот и других биологически активных веществ, способных оказывать комплексное влияние на механизмы стресс-индуцированных состояний и обладающих антигипоксической, стресс-протективной, антирадикальной, мембраностабилизирующей активностью [6; 7].

Ранними исследованиями было установлено содержание флавоноидов (гликозиды кверцетина, катехин и др.), антоцианов (гликозиды цианидина и др.), фенольных соединений (галловая кислота, феруловая кислота и др.), аминокислот в плодах Vaccinium praestans Lamb. (красника, или клоповка), доказана их гепатопротекторная, антирадикальная активность [8-10], что может представлять научный и практический интерес с точки зрения оценки стресс-протективного потенциала данных плодов при моделировании гипоксии различного генеза.

Цель исследования – произвести оценку стресс-протективного потенциала плодов V.praestans на модели острой гемической гипоксии, острой гистотоксической гипоксии и на модели предельного плавания in vivo.

Материалы и методы исследования

Определение стресс-протективного потенциала сока V. praestans в дозе 150 мг/кг и жидкого экстракта плодов V.praestans в дозе 150 мг/кг проводили путем установления наличия устойчивости к гипоксии различного генеза на 50 крысах-самцах линии Wistar массой 170,0-210,0г путем введения в течение 28 суток объектов исследования, при моделировании острой гемической гипоксии и острой гистотоксической гипоксии [11, с. 48] по изменению резервного времени жизни грызунов после внутрибрюшинного введения гипоксантов по сравнению с контрольной группой животных; по изменению показателей окислительного стресса – по содержанию малонового диальдегида (МДА) в печени и по уровню индекса антирадикальной активности печени (ИАА). Животные были поделены на пять групп: интактная группа была на стандартном питании; контрольной группе, помимо стандартного питания, вводился гипоксант; группа СК 150 мг/кг получала сок красники и гипоксант; группа ЖЭК 150 мг/кг – жидкий экстракт плодов красники и гипоксант; группа ГБ 40 мг/кг – оригинальный лекарственный препарат – экстракт гинкго двулопастного в дозе 40 мг/кг и гипоксант. По истечении 28 суток животным контрольной и опытных групп однократно внутрибрюшинно вводили нитрит натрия в дозе 200 мг/кг при моделировании острой гемической гипоксии или нитропруссид натрия в дозе 20 мг/кг при моделировании острой гистотоксической гипоксии.

Определение стресс-протективного потенциала объектов исследования проводили путем выявления наличия устойчивости к воздействию интенсивной физической нагрузки на 25 мышах-самцах линии ICR(CD-1) на модели предельного плавания с грузом, составляющим 7,5% от массы тела [12, с. 54], по изменению времени плавания по сравнению с контрольной группой животных; по изменению показателей окислительного стресса – по содержанию МДА в печени и по уровню ИАА печени. Животные были также поделены на пять групп, где животные контрольной группы, помимо стандартного питания, на 28-е сутки эксперимента были подвергнуты физической нагрузке, животные опытных групп получали в течение 28 суток объекты исследования и на 28-е сутки эксперимента также подвергались физической нагрузке.

Определение содержания содержания МДА в гомогенате печени проводили по стандартной методике, основанной на реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой при λ=532 нм и при λ=580 нм спектрофотометрически на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 PC (Япония) [13], ИАА – в гомогенате печени согласно методике, основанной на способности объектов исследования подавлять окисление ABTS-радикала активными формами кислорода, спектрофотометрически при λ=414 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-2550 (Япония) [14].

Все эксперименты над животными выполнялись в соответствии с Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств» [15], с положениями ГОСТа 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» [16], с Рекомендациями Коллегии Евразийской экономической комиссии от 14.11.2023 № 33 «О Руководстве по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований» [17]. По завершении исследований животных выводили из опыта передозировкой препаратов «Рометар» (20 мг/мл, Bioveta, Чехия) и KCl (Sigma Aldrich, США). Исследование было одобрено Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО «ТГМУ» Минздрава России (протокол №3 от 25.11.2024г.).

Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием программ Microsoft Excel 2010, Statistica, версия 13.3. Данные представлены в формате: медиана (Me) [Q1;Q3]. Нормальность распределений проверялась с помощью критерия Шапиро - Уилка. Сравнения между группами проводили при помощи непараметрического критерия Краскела - Уоллиса с последующим U-критерием Манна - Уитни для сравнения независимых групп в рамках эксперимента. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования показали, что введение сока красники статистически значимо увеличивает резервное время жизни опытных грызунов при острой гемической и гистотоксической гипоксии на 29,8% и 32,4% по сравнению с данными контрольной группы животных (р<0,05); введение жидкого экстракта плодов красники – на 59,9% и 65,2% соответственно (р <0,05), что было эквивалентно показателям препарата сравнения (табл.). При моделировании окислительного стресса при использовании стандартной методики вынужденного плавания с грузом применение жидкого экстракта плодов красники в дозе150мг/кг достоверно повышало выносливость опытных животных к воздействию интенсивной физической нагрузки на 60,7% по сравнению с данными контрольной группы животных (p<0,05), что превосходило показатели препарата сравнения. Введение сока красники не вызывало достоверных изменений данного показателя по сравнению с показателями контрольной группы животных (табл.).

Сравнительная оценка показателей при моделировании острой гемической гипоксии, острой гистотоксической гипоксии и интенсивной физической нагрузки, Me [Q1;Q3]

Группа животных	Острая гемическая гипоксия	Острая гистотоксическая гипоксия	Интенсивная физическая нагрузка
	Резервное время жизни, мин.	Резервное время жизни, мин.	Продолжительность плавания, с
Контрольная группа (n=5)	31,6 [30,4;32,1]	33,5 [31,5;36,3]	301,5 [277,0;316,2]
Сок красники, 150 мг/кг (n=5)	41,0 [39,5;41,8]*	44,5 [44,0;45,2]*	305,9 [293,8;342,2]
Жидкий экстракт красники, 150 мг/кг (n=5)	50,4 [48,6;53,3]*	55,3 [52,8;59,0]*	484,5 [472,3;493,8]*
Экстракт листьев гинкго двулопастного, 40 мг/кг (n=5)	50,9 [48,7;51,8]*	54,5 [48,5;60,5]*	444,9 [425,5;464,5]*

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем при р<0,05. Составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Введение метгемоглобин-образующего вещества (нитрита натрия в дозе 200 мг/кг) приводило к развитию перекисного окисления липидов и снижению неферментативного звена системы антиоксидантной защиты организма, на что указывает статистически значимое повышение МДА в 2,09 раза и снижение антирадикальной активности печени в 1,73 раза в контрольной группе по сравнению с данными животных интактной группы (p<0,05). В группе животных, которым вводили в течение 28 суток до начала эксперимента сок красники, наблюдалось статистически значимое снижение МДА на 24,6% (p<0,05) при отсутствии влияния на индекс антирадикальной активности печени (рис. 1). В группе животных, которым вводили в течение 28 суток до начала эксперимента жидкий экстракт красники, выявлено снижение МДА на 45,4% и повышение ИАА на 42,9% по сравнению с данными контрольной группы (p<0,05) (рис. 1).

 

а б

Рис. 1. Влияние сока V. praestans и жидкого экстракта плодов V. praestans на содержание МДА (а) и уровень ИАА (б) в гомогенате печени на фоне острой гемической гипоксии:

* – по сравнению с интактной группой животных при р <0,05;

# – по сравнению с контрольной группой животных при p<0,05.

Составлено авторами по результатам данного исследования

Введение ингибитора комплекса IV дыхательной цепи митохондрий (нитропруссида натрия в дозе 20 мг/кг) в эксперименте способствовало увеличению образования малонового диальдегида в гомогенате печени на 53,8% и снижению антирадикальной активности печени на 39,5% в контрольной группе животных по сравнению с интактной группой (p<0,05) (рис.2). Применение сока красники в течение 28 суток до введения нитропруссида натрия позволило статистически значимо снизить образование МДА на 20,6% в печени опытных животных (p<0,05) (рис.2а); применение жидкого экстракта красники приводило не только к снижению МДА на 29,1% в печени опытной группы животных, но и к повышению ИАА на 26,8% по сравнению с данными контрольной группы (p<0,05), что соответствовало данным препарата сравнения (рис.2).

а б

Рис. 2. Влияние сока V. praestans и жидкого экстракта плодов V. praestans на содержание МДА (а) и уровень ИАА (б) в гомогенате печени на фоне острой гистотоксической гипоксии: * – по сравнению с интактной группой животных при р <0,05; # – по сравнению с контрольной группой животных при p<0,05.

Составлено авторами по результатам данного исследования

На фоне интенсивной физической нагрузки выявлено статистически значимое повышение уровня МДА в 2,08 раза и снижение уровня ИАА в 2,10 раза в печени контрольной группы мышей по сравнению с данными интактной группы (p<0,05). Применение сока красники в течение 28 суток до начала эксперимента приводило к статистически значимому повышению антирадикальной активности печени опытных мышей на 29,2% (p<0,05) при неизменном уровне МДА по сравнению с данными контрольной группы (рис.3). Введение жидкого экстракта плодов красники в течение 28 суток до интенсивной физической нагрузки мышей способствовало не только повышению уровня ИАА на 59,3%, но и статистически значимо снижало МДА на 34,7% в печени по сравнению с контрольной группой животных, что превосходило данные препарата сравнения (p<0,05).

 

Рис. 3. Влияние сока V. praestans и жидкого экстракта плодов V. praestans на содержание МДА (а) и уровень ИАА (б) в гомогенате печени на фоне интенсивной физической нагрузки: * – по сравнению с интактной группой животных при р <0,05; # – по сравнению с контрольной группой животных при p<0,05.

Составлено авторами по результатам данного исследования

Изучению механизмов влияния биологически активных веществ растительных объектов на патофизиологические звенья стресс-индуцированных состояний в последнее время посвящено множество современных отечественных и зарубежных научных исследований [5; 18]. Так, реализация изучаемых фармакологических эффектов может быть связана с наличием идентифицированных ранее в жидком экстракте плодов красники полифенолов (гликозидов кверцетина, цианидина, катехина, фенольных кислот и др.) [8], основной механизм антигипоксического и стресс-протективного действия которых обусловлен снижением окислительного стресса и модификацией ключевых путей клеточного ответа на дефицит кислорода в условиях гипоксии за счет прямого поглощения свободных радикалов фенольной ОН-группой, связывания ионов переменных металлов (железа, меди) и снижения их реакционноспособности, подавления прооксидантных ферментов (ксантиноксидазы, НАДФН-оксидазы и др.), модуляции сигнальных каскадов, обеспечивающих клеточный стресс-ответ (MAPK, NF-κB и др.), стабилизации митохондриальной функции, восстановления уровня эндогенного глутатиона и др. [19]. Кроме того, в настоящее время доказан непрямой антигипоксический и стресс-протективный эффект аминокислот (лейцина, лизина, валина, аргинина и др.) через экспрессию фактора-2, связанного с эритроидным ядерным фактором (Nrf2), eNOS-зависимую вазодилатацию, влияние на уровни неферментативного звена эндогенной системы антиоксидантной защиты и т. д. [20], содержание которых было установлено в плодах красники [9]. Как утверждают авторы, механизм антигипоксического и стресс-протективного эффекта идентифицированных в соке красники органических кислот (яблочной, лимонной, янтарной кислот и др.) связывают с их влиянием на энергетический обмен и ресинтез АТФ, усилением экспрессии звеньев антиоксидантной системы и активности ферментов дыхательной цепи, ингибированием липолиза и участием в восстановлении мембран клеток при воздействии стресса и гипоксии, в том числе при интенсивной физической нагрузке [21], что в комплексе с другими биологически активными веществами может способствовать повышению устойчивости тканей к дефициту кислорода и стресс-индуцированным повреждениям.

Заключение

В результате исследования установлено, что сок красники способствовал увеличению резервного времени жизни и снижению МДА в печени при моделировании острой гемической и острой гистотоксической гипоксии, повышал ИАА печени при моделировании интенсивной физической нагрузки; жидкий экстракт плодов красники проявлял более выраженное действие, так как, помимо увеличения резервного времени жизни, снижал содержание МДА в печени, усиливал ИАА печени опытных животных при моделировании острой гемической гипоксии и острой гистотоксической гипоксии, повышал выносливость опытных животных, снижал МДА в печени и повышал уровень ИАА печени на фоне интенсивной физической нагрузки, что свидетельствует о наличии антигипоксической активности сока красники, антигипоксической и стресс-протективной активности жидкого экстракта плодов красники. Проведенное исследование расширяет представления о спектре фармакологической активности плодов красники.