Введение
В мире каждый год выявляют более 325 тысяч новых случаев меланомы кожи - одной из наиболее агрессивных онкологических патологий с низкой 5-летней выживаемостью при метастатическом варианте [1]. Стандартная таргетная терапия пациентов с мутациями BRAF включает комбинацию ингибиторов дабрафениба и траметиниба. Несмотря на высокую первичную эффективность, у 40–60% пациентов развивается резистентность к терапии в течение первых 12 месяцев [2]. Соответственно, этот факт делает актуальным поиск дополнительных молекулярных маркеров ответа на терапию у пациентов с мутациями BRAF.
Вариации числа копий генов (CNV) являются важным механизмом активации онкогенных сигнальных путей MAPK и PI3K, способствующим развитию резистентности к таргетной терапии [3]. В работе Кутилина Д. С. и соавторов [4] было показано, что у больных меланомой кожи с мутацией V600E в гене BRAF и отрицательным ответом на терапию ингибиторами протеинкиназ статистически значимо (p<0,001) повышено число копий генов BRAF, SOS1, KRAS, MEK1, ERK2 и PI3K в опухолевой ткани, что может свидетельствовать об активации сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK у данных пациентов независимо от наличия или отсутствия мутаций в гене BRAF. Эти данные имеют большое значение для развития персонализированной медицины, однако несколько ограничены использованием в исследовании тканевых биоптатов.
Традиционная молекулярная диагностика основана на анализе ДНК из тканевых образцов, полученных при инвазивной биопсии. Внеклеточная ДНК (внДНК), к которой относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу, ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК [5], циркулирующая в плазме крови, открывает возможности для малоинвазивного мониторинга опухолевого генома и прогнозирования ответа на терапию [6].
Исходя из описанного выше целью исследования стало изучение возможности использования показателя копийности ключевых генов сигнальных путей MAPK и PI3K во внеклеточной ДНК (внДНК) плазмы крови для прогнозирования эффективности терапии ингибиторами BRAF/MEK.
Материалы и методы исследования
Дизайн исследования
Проспективное одноцентровое исследование включало 100 пациентов с гистологически подтверждённой меланомой кожи III–IV стадии и выявленной мутацией BRAF V600E/K, а также 25 условно здоровых доноров крови (без онкопатологии). Все пациенты получали комбинированную терапию дабрафенибом (150 мг per os 2 раза в сутки) и траметинибом (2 мг per os 1 раз в сутки). Через 12 недель терапии проводили оценку ответа по критериям RECIST 1.1. Пациенты были разделены на 2 группы:
· группа 1 (чувствительные) - 62 пациента с полным или частичным ответом (CR/PR);
· группа 2 (резистентные) - 38 пациентов с прогрессированием заболевания (PD) или стабилизацией (SD).
Выделение внеклеточной ДНК
Забор крови проводили до начала терапии в вакуированные пробирки с EDTA. Плазму отделяли центрифугированием в течение 20 мин. при 1600 g, затем проводили повторное центрифугирование супернатанта при 16 000 g в течение 10 мин. Внеклеточную ДНК выделяли из 4 мл плазмы с использованием набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию ДНК оценивали на спектрофлуориметре.
Определение копийности генов
С опорой на работу Кутилина Д. С. и соавторов [4] для исследования была выбрана панель генов BRAF, KRAS, MEK1, ERK2, SOS1 и PI3K. Копийность генов определяли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием красителя EvaGreen® (Biotium, США) на термоциклере Bio-Rad CFX96. В качестве референсных генов использовали ACTB и GAPDH. С использованием базы данных NCBI GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и онлайн-инструмента Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) были разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов, в том числе для референсных локусов (табл.).
Перечень синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для определения числа копий генов
|
Ген |
Праймер (5'->3') |
|
SOS1 |
F: CCTCTTTGGCTGCTGACAT |
|
KRAS |
F:TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTA |
|
BRAF |
F: TCCCTCTCAGGCATAAGGTA |
|
MEK1 |
F: CAGCTTCAGCTGTGGTTTCT |
|
ERK2 |
F: TGGCTACACCTTCGACATCC |
|
PI3K |
F: CCTCTTGCTGTTTCACCA |
|
ACTB |
F: CATGTACGTTGCTATCCAGC |
|
GAPDH |
F: CCTGAACGGGAAGCTCАC R: GCAGGTTTTTCTAGACGGCAT |
Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Амплификация каждого образца осуществлялась в 3 повторах. При этом усредненные данные по каждому локусу нормализовались относительно усредненного показателя референсных генов: ΔC(t)=C(t)(среднее геометрическое гена мишени) – C(t)(среднее геометрическое референсных генов). Копийность гена (rCN) вычисляли по формуле rC=Е-ΔΔC(t), где Е - эффективность реакции амплификации, рассчитанная по формуле E=10-1/h, где h - коэффициент уравнения C(t) = h•log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных (Е=1,99). Далее вычисляли среднее геометрическое rCп для образцов внДНК пациентов и rCNу для образцов внДНК условно здоровых доноров по каждому генетическому локусу и рассчитывали кратность изменения (fold change, FC) копийности генов: FC = rCNпациентов/rCNусловно здоровых [7].
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0. Для сравнения групп применяли U-критерий Манна - Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для визуализации общего профиля копийности генов у всех пациентов была построена тепловая карта, где по оси X отображены гены, а по оси Y - пациенты, сгруппированные по ответу на терапию. Для определения наиболее значимых маркеров чувствительности к терапии был применен лассо-пенализованный регрессионный анализ с использованием пакета scikit-learn в Python. В модели в качестве зависимой переменной использовался ответ на терапию (1 = чувствительный, 0 = резистентный), а в качестве независимых переменных - копийность каждого гена. Модель настраивалась с использованием 10-кратной кросс-валидации для оптимизации параметра регуляризации α.
Работа выполнена с использованием научного оборудования ЦКП НМИЦ онкологии МЗ РФ (регистрационный номер 3554742, https://ckp-rf.ru/catalog/ckp/3554742/).
Результаты исследования и их обсуждение
У всех 100 пациентов до начала терапии во внеклеточной ДНК плазмы крови была подтверждена мутация BRAF V600E (n=92) или V600K (n=8). Через 12 недель терапии объективный ответ (CR/PR) зафиксирован у 62 пациентов (62%), отсутствие ответа/прогрессирование - у 38 пациентов (38%).
Анализ копийности генов во внеклеточной ДНК выявил статистически значимые различия между группами. У пациентов с резистентностью к терапии наблюдалось достоверное увеличение копийности: гена BRAF в 2,1 раза (p<0,001), гена KRAS в 2,4 раза (p<0,001) и гена PI3K (PIK3CA) в 3,5 раза (p<0,001) по сравнению с внДНК группы чувствительных к терапии пациентов (рис. 1).
Рис. 1. Сравнение относительной копийности генов BRAF, KRAS и PI3K во внеклеточной ДНК плазмы крови у пациентов с различным ответом на терапию ингибиторами BRAF/MEK (на графике box-plot представлены значения FC, нормализованные относительно копийности генов во внДНК условно здоровых доноров); * - статистически значимые отличия относительно группы с клинически значимым ответом на терапию (p<0,001). Составлено авторами по результатам данного исследования
Повышенная копийность гена BRAF (в 2,1 раза) у резистентных пациентов может приводить к гиперэкспрессии мутантного белка BRAF V600E/K, что создает избыток мишени для ингибиторов. Даже при частичной блокаде активности киназы оставшаяся фракция мутантного белка способна поддерживать активацию сигнального пути MAPK на уровне, достаточном для выживания опухолевых клеток [8]. Этот механизм резистентности аналогичен описанному в исследованиях устойчивости к таргетной терапии при других онкологических заболеваниях, где амплификация целевого гена компенсирует ингибирование его активности [9].
Увеличение копийности гена KRAS (в 2,4 раза) представляет собой альтернативный механизм активации сигнального пути MAPK. KRAS является ключевым узлом передачи сигнала от рецепторов факторов роста к эффекторным киназам. Амплификация этого гена может приводить к конститутивной активации не только каскада RAS-RAF-MEK-ERK, но и параллельных путей, включая PI3K/AKT [10]. Это особенно важно, поскольку даже при эффективной блокаде мутантного BRAF активированный KRAS способен запускать сигнальную трансдукцию через другие члены семейства RAF (ARAF, CRAF), обеспечивая байпасную активацию пути [11].
Наиболее выраженное увеличение копийности наблюдалось для гена PI3K (PIK3CA) (в 3,5 раза), что указывает на критическую роль пути PI3K/AKT/mTOR в развитии резистентности к ингибиторам BRAF/MEK. Сигнальный путь PI3K функционирует параллельно с каскадом MAPK и регулирует ключевые процессы клеточной выживаемости, метаболизма и пролиферации. Активация PI3K может компенсировать блокаду пути MAPK, поддерживая жизнеспособность опухолевых клеток и способствуя прогрессированию заболевания [12].
Полученные данные демонстрируют чёткую корреляцию между копийностью генов во внеклеточной ДНК плазмы крови и эффективностью таргетной терапии меланомы кожи ингибиторами BRAF/MEK.
Тепловая карта (рис. 2) демонстрирует общую картину копийности генов у всех пациентов, сгруппированных по ответу на терапию. Первые 62 пациента представляют группу чувствительных к терапии, а последующие 38 - резистентных. Заметно, что в группе резистентных пациентов наблюдается более высокая копийность всех исследуемых генов, особенно PI3K, которая достигает значений до 3.5-4.0 fold change.
Рис. 2. Тепловая карта относительной копийности генов BRAF, KRAS и PI3K у 100 пациентов с меланомой кожи. Пациенты сгруппированы по ответу на терапию: первые 62 пациента - чувствительные к терапии, последующие 38 - резистентные. Составлено авторами по результатам данного исследования
Визуализация позволяет легко выявить паттерны копийности, характерные для разных групп пациентов. В группе чувствительных пациентов копийность генов в основном колеблется в пределах 1.0-1.5 fold change, тогда как в группе резистентных пациентов значения гораздо выше, особенно для PI3K и KRAS. Это подтверждает гипотезу о том, что повышенная копийность генов сигнальных путей MAPK и PI3K ассоциирована с резистентностью к терапии.
Лассо-пенализованный регрессионный анализ (рис. 3) был применен для определения наиболее важных маркеров чувствительности к терапии. В модели в качестве зависимой переменной использовался ответ на терапию (1 = чувствительный, 0 = резистентный), а в качестве независимых переменных - копийность каждого гена.
Рис. 3. Коэффициенты лассо-регрессионной модели, показывающие вклад каждого гена в предсказание ответа на терапию.
Составлено авторами по результатам данного исследования
Результаты показывают, что ген PI3K (PIK3CA) имеет наибольший положительный коэффициент регрессии (0.85), что указывает на его ключевую роль в развитии резистентности к терапии. Следующим по значимости является ген BRAF (коэффициент 0.72), который активирует RAS и запускает сигнальный каскад MAPK. Ген KRAS также имеет значимый положительный коэффициент (0.45), что подтверждает его роль в резистентности. Отрицательные коэффициенты (не представлены в данном случае) указывали бы на гены, чье повышение копийности ассоциировано с чувствительностью к терапии. В проведенном исследовании все значимые гены демонстрируют положительную корреляцию с резистентностью, что соответствует предыдущим наблюдениям. Лассо-регрессия также показала, что ERK2 имеет наименьший коэффициент (0.18), что указывает на его меньшую значимость для предсказания ответа на терапию по сравнению с другими генами. Это может быть связано с тем, что ERK2 является конечным эффектором в сигнальном каскаде MAPK, и его активность может быть более специфичной для определенных типов мутаций BRAF.
Использование внеклеточной ДНК плазмы крови в качестве источника для молекулярного анализа обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционной тканевой биопсией. Во-первых, метод является полностью малоинвазивным и может повторяться в динамике для мониторинга ответа на терапию и раннего выявления развития резистентности [13]. Во-вторых, внеклеточная ДНК отражает геномную гетерогенность опухолевого процесса в целом, включая все метастатические очаги, что особенно важно при меланоме с её высокой склонностью к диссеминации [14]. В-третьих, анализ внДНК позволяет преодолеть проблему пространственной и временной гетерогенности опухоли, которая часто ограничивает прогностическую ценность единичной тканевой биопсии [15]. Данное исследование подтверждает, что определение копийности генов во внеклеточной ДНК может служить надёжным прогностическим маркером эффективности таргетной терапии.
Выявленные закономерности открывают возможности для оптимизации тактики лечения пациентов с меланомой кожи. Пациенты с повышенной копийностью генов BRAF, KRAS или PI3K во внеклеточной ДНК до начала терапии могут быть отнесены к группе высокого риска развития первичной резистентности к ингибиторам BRAF/MEK. Для таких пациентов целесообразно рассмотреть альтернативные стратегии лечения, включая:
1) комбинированную терапию с ингибиторами как пути MAPK, так и PI3K/AKT/mTOR;
2) иммунотерапию ингибиторами контрольных точек (анти-PD-1, анти-CTLA-4);
3) участие в клинических исследованиях новых таргетных препаратов.
Таким образом, рутинное определение копийности генов во внеклеточной ДНК может стать важным компонентом персонализированного подхода к лечению меланомы, позволяя избежать неоправданного назначения препаратов пациентам с низкой вероятностью ответа.
Заключение
В ходе проведенного исследования у пациентов с меланомой кожи и резистентностью к терапии ингибиторами BRAF/MEK выявлено статистически значимое увеличение копийности генов BRAF (в 2,1 раза), KRAS (в 2,4 раза) и PI3K (в 3,5 раза) во внеклеточной ДНК плазмы крови по сравнению с пациентами, чувствительными к терапии. Повышенная копийность данных генов ассоциирована с активацией сигнальных путей MAPK и PI3K независимо от мутационного статуса BRAF, что обусловливает развитие резистентности к таргетной терапии. Тепловая карта и лассо-регрессионный анализ подтверждают, что PI3K и BRAF являются наиболее значимыми маркерами резистентности, что делает их ключевыми кандидатами для дальнейших исследований и потенциальными мишенями для комбинированной терапии. Определение копийности генов BRAF, KRAS и PI3K во внеклеточной ДНК плазмы крови представляет собой перспективный малоинвазивный метод прогнозирования эффективности терапии и персонализации лечения меланомы. Внедрение рутинного анализа CNV указанных генов в клиническую практику позволит оптимизировать выбор терапевтической стратегии и избежать её неэффективности.